Vsg: velocidad de sedimentacion globular



Descargar 86.87 Kb.
Fecha de conversión28.10.2018
Tamaño86.87 Kb.

MONTAJE PRUEBAS HEMATOLOGIA

1. VSG: VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR

Determinación de la VSG


Habitualmente se emplean dos procedimientos:

Método Westergreen

Método de Wintrobe

En la actualidad no existe ningún método de referencia para la determinación de VSG, aunque el ISCH (International Commitee for Standardization in Hematology) recomienda el de Westergreen como el más aconsejable para la práctica clínica. El método se describe a continuación


Método de Westergreen


1- Extraer sangre venosa (aprox. 1-2 mL) y homogenizar con el anticoagulante. Se recomienda realizar la determinación dentro de las 2 horas posteriores a la extracción de la muestra.

2- Cargar una pipeta de Westergreen y en el momento de llegar a la marca 0, poner en marcha el cronómetro. Asegurarse que la pipeta esta en una posición de 90 º respecto la superficie, exenta de vibraciones o cualquier factor que modifique la VSG.

3- Transcurridos 60 minutos exactos, leer la sedimentación eritrocitaria, que se expresa en mm/hora y comparar los resultados obtenidos con los resultados normales.

Indicaciones


La VSG es una prueba analítica análoga a las conocidas como reactante de fase aguda, como lo es la proteína C reactiva o PCR. Esto significa que es un marcador inespecífico, no relacionado con ninguna enfermedad en concreto, cuya elevación implica procesos inflamatorios, infecciosos o neoplásicos. Por otra parte, sus valores son ampliamente variables por múltiples factores aún mal establecidos (se sabe que aumenta con la edad), por lo que su interpretación debe estar en el contexto de la clínica y el resto de pruebas analíticas. Existen tablas de valores normales máximos por edad y sexo (por ejemplo, 10 mm por hora en varones jóvenes).

La VSG se utiliza como dato de rutina en el despistaje inicial de enfermedades, como seguimiento de múltiples enfermedades crónicas, y excepcionalmente como criterio de diagnóstico (por ejemplo en la arteritis de células gigantes). Algunos procesos también pueden presentar disminución de la VSG.


2. RETICULOCITOS


Información: Los reticulocitos son eritrocitos jóvenes "recién nacidos" que ocupan una posición intermedia entre los eritrocitos maduros anucleados y los precursores eritroides nucleados que se encuentran en la médula ósea. Se consideran como el mejor índice para evaluar cómo está la producción de glóbulos rojos en la médula ósea.

Usos: De utilidad en anemias hemolíticas, en estados post- hemorrágicos, cuando se recibe tratamiento para su anemia bien sea originada por carencia de vitamina B 12 en la anemia perniciosa o hierro en la ferropénica.

Normales: La cifra normal en los extendidos periféricos está comprendida entre 0.2 al 2. 6 % en hombres y de 0.2 a 2. 4 % en mujeres.

METODO AZUL DE CRESIL BRILLANTE:


  • Azul de cresil brillante……………………  1.0  gr

  • Solución salina al 0.85% ………………..   99 ml

  • Citrato de sodio……………………………..0.4 gr

METODO:
Tomar un tubo y agregar partes iguales de sangre bien mezclada y solución de ACB, también pueden ser dos gotas de sangre del paciente por una gota de colorante.

 Mezclar varias veces y fuertemente  el tubo con la mezcla de sangre-colorante (durante 10 minutos) y se deja en reposo a temperatura ambiente  por 30 minutos ó en Baño de Maria por 15 minutos, para asegurar tiempo adecuado para colorear los reticulocitos.

 Mezclar la solución y se hacen dos frotis en laminas portaobjetos limpias.

La prueba consiste en la administración de un "anti-suero" que contiene anticuerpos dirigidos contra una serie de moléculas presentes en la membrana de los eritrocitos; la unión del anti-suero con estos eritrocitos ocasiona una reacción inmediata de aglutinación. La prueba de Coombs se utiliza como método diagnóstico de enfermedades como las anemias hemolíticas, la enfermedad hemolítica del recién nacido y en las reacciones transfusionales.



3. COOMBS DIRECTO


 PROCEDIMIENTO MANUAL:

  • Lave tres veces los hematíes del paciente con solución salina fisiológica.

  • Haga una suspensión de hematíes lavados al 2-5 %.

  • Añada en un tubo debidamente rotulado dos gotas de la suspensión.

  • Añada dos gotas de Suero de Coombs poliespecífico.

  • Centrifugue un minuto a 1000 rpm.

4. COOMBS INDIRECTO


A diferencia de la prueba de Coombs directa, la prueba indirecta se basa en la "incubación" del suero del paciente con una muestra de sangre tipo O, y posteriormente se procede a administrar el "anti-suero". A diferencia de la prueba directa, en la prueba indirecta se busca la presencia de "anticuerpos" en el suero del paciente y no "anticuerpos" pegados a la superficie de los glóbulos rojos. La prueba indirecta se usa para realizar "tipificación" de grupos sanguíneos, pruebas sanguíneas cruzadas y como método de rastreo para evitar reacciones transfusionales.

 PROCEDIMIENTO MANUAL


  • Centrifugue la muestra de sangre 10 min a 3 000 rpm para obtener el suero y decántelo en un tubo debidamente identificado.

  • Prepare una suspensión al 2-5 % con la mezcla de hematíes O y en el caso del Coombs cruzado utilice una muestra de la sangre a transfundir para preparar la suspensión.

  • En un tubo debidamente rotulado añada dos gotas del suero y dos gotas de la suspensión y mezcle bien.

  • Prepare un tubo control rotulado C+ (control positivo) y añada en él dos gotas de la suspensión de hematíes O y dos de suero hemoclasificador anti-D y mezcle bien

  • Incube ambos tubos en un Baño de María a 37ºC por 30 minutos

  • Lave tres veces con solución salina escurriendo totalmente el sobrenadante del último lavado.

  • Añada dos gotas de suero de Coombs poliespecífico a cada tubo.

  • Centrifugue 1minuto a 1000 rpm.


5. EXTENDIDO DE SANGRE PERIFERICA

 TECNICA MANUAL CON DOS PORTAOBJETOS EN ANGULO:

Se recomienda usar dos portaobjetos de vidrio nuevos con bordes biselados y esquinas romas.

El tamaño de la gota de sangre también es muy importante, si es muy grande crea un extendido muy largo y grueso y viceversa.

El portaobjetos extensor se sostiene con firmeza a un ángulo de 30 a 45º y se lleva hacia atrás hacia la gota de sangre, dejando que ésta se esparza en todo el ancho del portaobjetos.

Entonces se empuja con rapidez y suavidad hacia delante hasta el final del portaobjetos y se crea un extendido. Es importante que toda la gota se incluya en el extendido.

Características de un buen extendido:

  • Cubre alrededor de dos tercios a tres cuartas partes de la longitud del portaobjetos

  • Tiene forma de dedo no forma de bala

  • Los bordes laterales deben ser visibles

  • El extendido es parejo, sin irregularidades, hoyos ni estrias

  • Secar rápidamente

Coloración:

Se emplea la tinción de Wright

  • Se realiza sobre un soporte para coloraciones, los portaobjetos se colocan sobre el soporte boca arriba una vez secos.

  • El colorante de Wright se puede preparar o venir listo para su uso y debe filtrarse antes de usarlo.

  • Es importante cubrir todo el portaobjetos con el colorante

  • Mezclar con un agua o buffer hasta que aprezca un color brillante sobre la lamina

  • Se suele mezclar soplando el reactivo con el buffer

  • La mezcla se deje por al menos 3 minutos (cada laboratorio estandariza su técnica de acuerdo a su reactivo).

  • Cuando termina la coloración el portaobjetos se lava con un chorro continuo pero suave de agua con pH neutro.

  • Limpiar la parte de atrás para limpiar el residuo del colorante

  • Secar al aire en posición vertical

6. GOTA GRUESA


El examen de un preparado de sangre en "gota gruesa" es el primer paso para el diagnóstico de malaria. Si son vistos parásitos, se debe hacer un extendido para verificar la especie.


Gota gruesa: se coloca una gota de sangre en un portaobjetos limpio y con la esquina de otro, se disemina la sangre hasta llegar a un diámetro de más o menos 1 cm. El espesor debe ser tal que permita leer a través de la preparación. Se realiza de punción del dedo.

Solución A

 

Cloruro de azul de metileno para microscopia                                   0.8 g



Azur l o azur B para microscopia                                                       0.5 g

 

Cuando no se tienen los anteriores reactivos, pueden ser reemplazados por 1,3 g de azur ll. Para disolver el colorante se utilizan 250 ml de agua amortiguadora pH 7.2.



  

Solución B 

Eosina amarillenta hidrosoluble para microscopia                                1 g

Disolver la eosina amarillenta en 250ml de agua amortiguadora pH 7.2.

 

Las soluciones A y B se almacenan en frascos ámbar. Para el uso diario se recomienda que sean alícuotas en frascos goteros de plástico que impidan el paso de la luz, los cuales deben dispersar gotas del mismo tamaño. Cada vez que se realice una coloración los frascos se cierran muy bien para evitar que haya contaminación de los colorantes.



 

Las soluciones se pueden almacenar a 4oC, sin que sus componentes se precipiten.

 

Cuando sea necesario, se debe realizar filtración de estas dos soluciones, en recipientes limpios en caso de observar contaminación y precipitado.



  

 
Procedimiento de coloración para gota gruesa

 

La coloración para gota gruesa consta de dos pasos: precoloración y coloración.



 
Precoloración

 

Este proceso ayuda a preservar las células sanguíneas e iniciar el proceso de deshemoglobinizacion sin alterar la morfología del parasito.



 

• Verificar que la muestra este completamente seca para que no se desprenda

 

• Sumergir la lamina en una solución de azul de metileno por dos segundos



 

• Escurrir la lamina sobre una gasa o papel absorbente para eliminar el exceso de azul de metileno

 

• Introducir la lamina en un recipiente que contenga una solución amortiguadora pH 7.2, por dos segundos



 

• Esta solución se cambia cada vez que tenga mucho tinte azul proveniente del azul de metileno

 

• Cuando las muestras precoloreadas han tomado un exceso de azul de metileno fosfatado, se pueden volver a enjuagar para evitar muestras muy oscuras



 

• Deje escurrir las láminas para continuar la coloración

 

• En los casos en que no es posible colorear inmediatamente, se procede a secar los porta objetos a temperatura ambiente o con calor, suave y de manera rápida para prevenir el desarrollo de hongos. Se debe evitar la sobreexposición al calor porque se fija la hemoglobina de los glóbulos rojos.


Coloración

 

Después de la deshemoglobinizacion, la coloración permite la diferenciación de las estructuras parasitarias. El color esperado para la cromatina es el rojo; para el citoplasma es azul y el pigmento malarico varía entre el amarillo y el café oscuro.



 

• Por cada lámina que se necesita colorear, se adicionan 3 ml de solución amortiguadora, una gota de solución A y una gota de solución B en un tubo, y se mezcla suavemente por inversión

 

• Las muestras se colocan hacia la concavidad de la lámina de coloración; se adiciona la solución colorante evitando la formación de burbujas y se deja actuar según el tiempo estandarizado de la coloración. La posición invertida de la gota gruesa permite una deshemoglobinizacion completa por el alto peso molecular de la hemoglobina



 

• Pasado el tiempo de coloración, coloque las láminas en posición vertical en el soporte y deje escurrir. No necesita lavar la muestra ya que puede desprenderla.




7. TIEMPO DE SANGRIA

Método de Ivy


El método de Ivy es la forma más tradicional de realizar el examen. Se realiza una incisión superficial en la piel del antebrazo o el lóbulo auricular y se mide el tiempo que tarda en detenerse la hemorragia. La incisión mide 10 mm de largo y 1 mm de profundidad. El tiempo desde el cual se realiza la incisión y la herida para de sangrar es conocido como el tiempo de sangría. Cada 30 segundos se utiliza papel filtro para secar la sangre, sin presionar para evitar la alteración del examen. Se considera normal un tiempo de sangría de alrededor de 3 a 11 minutos.

Método de Duke


En el método de Duke, se pincha al paciente con una aguja especial o lanceta, preferentemente en el lóbulo auricular o la yema de los dedos, luego de limpiarlo con alcohol. La punción es de 3-4 mm de profundidad. El paciente limpia la sangre con un papel de filtro cada 30 segundos. El test termina cuando cesa la hemorragia. El tiempo usual es de entre 2 y 5 minutos.

8. TIEMPO DE COAGULACION

QUÉ ES?


Material a estudiar: sangre venosa extraida en tubo seco

Finalidad: determina el tiempo que tarda en coagular la sangre recién extraída. Evalúa la vía intrínseca de la coagulación. Al mismo tiempo evalúa en términos generales: el fibrinógeno y el número y calidad de las plaquetas. Sirve además para controlar los tratamientos con heparina aunque con menos certeza que el tiempo parcial de tromboplastina activada.

Preparación previa: no es necesaria.

Resultados:

Valores normales: tiempo de coagulación 5 a 15 minutos. Retracción: comienza después de 1 hora de coagulado observándose una retracción del 50 %.

Valores anormales: Hiperfibrinogenemia. Anemia. Fibrinolisis secundaria.

Tiempo de coagulación prolongados: deficiencia de factores de la coagulación. Presencia de anticoagulantes.

Retracción lenta o incompleta del coágulo: Trombocitopenia. Tromboastenia.

Tiempo necesario para obtener los resultados: Varias horas de observación para determinar primero el tiempo que tarda en coagular la sangre extraída y el tiempo que tarda el coágulo en retraerse para soltar finalmente el suero de la sangre.

Equipamiento a utilizar: además de la jeringa de extracción y la aguja para la punción venosa, el médico o técnico deberá contar con un cronómetro y un baño de agua caliente a 37 grados Cº.

Confiabilidad de los resultados: buena.

Medicamentos que pueden alterar los resultados:

Antibióticos (tetraciclinas)

Anticoagulantes


Corticoesteroides

MONTAJE PRUEBAS UROANALISIS

1. PARCIAL DE ORINA


1. Mezclar bien la orina antes de analizar.

2. Pasar la muestra a un tubo graduado o no debidamente identificado y observar:

a) Color: Varía de ambarino al amarillo pálido, según su contenido en pigmentos, especialmente el urocromo, y en menor proporción la uroeritrina y la hemato porfirina. La intensidad del color es inversamente proporcional al volumen eliminado y la densidad de la orina.

Coloraciones normales: Incolora, de color amarillo claro, amarillo oscuro o ámbar intenso.

Coloraciones patológicas: Rojo o rojo pardusco, rojo pardusco o pardo negro, amarillo verdoso o caoba oscuro, latescente, pardo al negro al oxidarse.

Cloraciones medicamentosas: Azul - verdoso, rosado o rojo en orinas alcalinas, rojo, rosado, amarillo ámbar, pardusco que vira al rojo al alcalinizarse.

b) Olor: El olor normal de la orina es un débil olor aromático, pero con el tiempo adquiere un olor amoniacal desagradable debido a la descomposición. El olor de las orinas ácidas y concentradas es más fuerte (después de la ingestión de carne, ejercicios violentos, etc).

3. Luego de introducir la tira reactiva por parte del bacteriólogo se lleva la muestra a centrifugar por 10 minutos a 3500 r.p.m.

4. Luego de ese tiempo descartar el sobrenadante y mezclar el sedimento.

5. Tomar una gota del sedimento y colocarla sobre un portaobjeto, cubrir con una laminilla y disponer para su lectura.

2. ORINAS DE 24 HORAS


1. Mezclar bien la orina antes de analizar.

2. Verter en una probeta graduada todo el volumen urinario recolectado por el paciente

3. Anotar el volumen y comunicar al Bacteriólogo en mL según la identificación del paciente.

MONTAJE PRUEBAS COPROANALISIS

  1. COPROLOGICOS Y/O COPROSCOPICOS


1. Identificar la lámina de acuerdo al número de identificación del recipiente

Exámen Macroscópico: Las heces se clasifican en liquidas, blandas o duras. El color anormal tiene significado patológico, por ejemplo: negro en melenas, blanco en acolia.

Debe observarse si existe moco, sangre, restos alimenticios o presencia de parásitos grandes como helmintos o platelmintos.

MONTAJE: En un portaobjetos se coloca separadamente una gota de solución salina fisiológica (0.85%) y otra de lugol(yodo 1.5gramos, yoduro de potasio 4 gramos y agua destilada 100 ml)

- Con un palillo se toma una pequeña porción de materia fecal y se hace una suspensión en gota de solución salina y luego se repite el mismo procedimiento en la gota de lugol

- Se cubren con portaobjetos de 22 x 22 mm y se observa al microscopio con objeto de 10X y luego 40X, se deben evitar preparaciones muy gruesas o muy delgadas poder ver bien a través de ellas. Los parásitos móviles se observan en solución salina. El lugol hace resaltar algunas estructuras, como núcleos de protozoos y da una coloración café a los huevos y larvas.


2. Para Coproscópicos se sigue el mismo procedimiento de montaje pero se incluyen los siguientes análisis:


- Medición de pH: Se mide con papel indicador, colocando una pequeña cantidad de materia fecal con el aplicador sobre la tira de papel reveladora, quitar el excedente, comparar el color con la escala que provee la casa comercial.

- Azúcares reductores: Se realiza una suspensión acuosa de la materia fecal y se agrega el reactivo Clinitest. La suspensión se prepara con agua destilada. EL reactivo de clinistest es una pastilla que se adiciona a la suspensión y de acuerdo al cambio de color determina la presencia o no de azúcares reductores en la muestra.

Utilidad: Detectar deficiencia de enzimas intestinales, principalmente de sucrosa y lactosa (disacáridasas), debido a una deficiencia congénita o daños inespecíficos en la mucosa.

- Sangre oculta: Varía de acuerdo a la casa comercial o el reactivo empleado.


  1. TINCION DE ZIEHL NEELSEN MODIFICADA PARA CRYSPTOSPORIDIUM


Esta tinción sirve para observar coccidias intestinales tales como: Cryptosporidium sp, Cyclospora sp; Isospora sp. Etc, que son parásitos intestinales que hoy día están afectando principalmente pacientes inmunosuprimidos :

Técnica:

- Colocar en un portaobjetos nuevo, libre de grasa y seco una gota de solución salina al 0.85%. Homogenizar muy bien la muestra de materia fecal con un palillo de madera de tal manera que quede un extendido aproximado de 2 cm de largo por 2 de ancho.

- Dejar secar a temperatura ambiente.

- Fijar la placa con calor.

- Dejar secar al medio ambiente.

- Cubrir el extendido de la placa con carbol-fuschina durante 10 minutos. NO APLICAR CALOR.

- Lavar con agua de chorro hasta quitar el colorante.

- Decolorar con acido sulfúrico a la concentración requerida hasta que la placa quede de un color rosado pálido.

- Lavar con agua de chorro para eliminar el exceso del colorante.

- Cubrir con azul de metileno o verde de malaquita por 3 minutos.

- Lavar con agua de chorro para eliminar el exceso de colorante.

- Dejar secar la placa.

  1. COLORACION DE WRIGHT PARA LEUCOCITOS


Se realiza un extendido delgado y homogéneo, preferiblemente de la parte que contenga mas moco en una placa limpia y seca. Se deja secar muy bien y se realiza la coloración cubriendo el extendido con el colorante de Wright por 3 minutos y luego se agrega agua destilada a PH de 6.7 a 7 durante 5 minutos. Lavar con agua y dejar secar, observar con objetivo de 100X.

MONTAJE PRUEBAS QUIMICA CLINICA E INMUNOLOGIA


Separación de suero o plasma

El Suero o plasma debe ser separado lo mas pronto posible, salvo en casos donde se demuestre que puede permanecer mas tiempo sin separarse.

El limite máximo se de DOS HORAS

NOTA: Un tiempo menor a dos horas se recomienda para Potasio, ACTH, Cortisol, Catecolaminas y homocisteina:


Las muestras para SUERO deben coagular antes de ser centrifugadas


Tratar de evitar la hemólisis.

· Los test o pruebas que se afectan seriamente por la hemólisis son: LDH, Potasio y GOT.

· Los test o pruebas que se afectan moderadamente son: Fósforo, proteínas, albúmina, magnesio y calcio.

· Evitar la exposición a la luz en el caso de bilirrubina.

· Algunas pruebas requieren sangre entera (e.g., plomo, cyclosporin, y HemoglobinaA1C ). Estos especímenes no deben ser centrifugados. Si está centrifugado accidentalmente, no deseche el espécimen; envíe el tubo centrifugado.
Los tubos de la sangre deben ser mantenidos cerrados siempre preferiblemente y la centrifuga debe ser cerrada para evitar aerosoles.
· Mantener el tubo una posición cerrada elimina la contaminación exógena posible del espécimen y previene la evaporación y la posibilidad de derramamientos y de aerosoles.
Preparación previa al centrifugado

Lo ideal es no usar un separador plástico (palito revolvedor), pero si es necesario, hacerlo con cuidado para evitar la hemólisis. Asegurarse de tapar el tubo nuevamente luego de este procedimiento. El tubo debe permanecer tapado en todo momento.



Fase de Centrifugado

Las muestras en las que se realizara monograma (electrolitos), deben permanecer el tiempo necesario para coagular y no se deben centrifugar más de una vez, ya que se incrementa falsamente el valor de potasio.


Se deben centrifugar las muestras de sangre a 2500-3000 rpm durante 15 minutos.
Fase post Centrifugado

  • Cuando sea necesario separar suero o plasma, se debe hacer en el menor tiempo posible y con todo el volumen del mismo, la separación se realizará en un tubo limpio y seco previamente marcado con los datos del paciente y luego de comprobar que se trata de la misma etiqueta en ambos tubos, se separará por volcado, no se debe guardar el coagulo restante.




  • Una vez separado el suero debe ser refrigerado hasta su transporte o análisis

  • De cualquier manera esta demostrado, que la mayoría de los analitos, salvo excepciones ya mencionadas, son estables por más de 24 hs, y al menos por 8 hs a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, deben ser refrigerados. En el caso de remitirse muestras, éstas deben refrigerarse inmediatamente par el envío en cadena de frío

  • Las muestra para glucosa en neonatos deben ser procesadas inmediatamente, ya que sufren glicólisis mas rápidamente.

MONTAJE PRUEBAS COAGULACION

Las muestras que requieren PLASMA se deben separar tan pronto como sea posible los tubos deben permanecer en posición vertical.



Tratar de evitar la hemólisis.
Se deben centrifugar las muestras de sangre con citrato de sodio a 2500-3000 rpm durante 15 minutos.

MONTAJE PRUEBAS MICROBIOLOGIA

COLORACIONES

1. Coloración de Gram:

La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura celular.

Preparación de la extensión:   de elección sería utilizar portas mantenidos en un contenedor con alcohol, los cuales se sacan y secan (al aire o por flameado) justo antes de su uso. La extensión debe de rendir una fina monocapa representativa de la muestra:
                    - Torundas:   hacerlas rodar ligeramente sobre el porta para evitar la destrucción de elementos celulares y bacterias. Dejar secar al aire.
                    - Aspirados, exudados, esputos, heces, ... (muestras sin torundas):   seleccionar las partes más purulentas y/o hemáticas, y tras depositar una pequeña fracción (con un asa, torunda, aplicadores estériles…) hacer la extensión con 2 portas:

- LCR y otros líquidos que requieren centrifugación: tras centrifugación (2.500-3.000 rpm durante 15 min.), desechar el sobrenadante y utilizar el sedimento (0,5 ml), homogeneizándolo, verter una gota en un porta y dejar secar al aire. Puede añadirse, opcionalmente, una segunda gota a la primera ya seca para aumentar la sensibilidad.
                    -
Orina:   sin centrifugarla, homogeneizar y depositar una gota sobre el porta dejándola secar al aire (se considera que existen > 100.000 UFC/ml orina si se observa > 1 bacteria/campo de alto aumento [x1000] en todos los campos visualizados).
                    -
Muestras muy reducidas:   emulsionarlas con 0,5 ml de solución salina estéril, agitar y depositar 1 gota en el porta, extenderla en una capa fina con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire.
                    -
Biopsias:   la técnica más utilizada es la extensión por cortado y toques:
                                           
FIGURA
                    -
Cultivos líquidos:   depositar con pipeta Pasteur o con jeringa-aguja estériles (hemocultivos, cultivos bifásicos de Castañeda…), 1 ó 2 gotas en el porta y hacer una extensión fina con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire.
                -
Colonias en medio sólido:   colocar 1 gota de agua o solución salina (preferible, ya que el agua puede distorsionar la morfología celular de microorganismos frágiles) en un porta, depositar con un asa o aplicador estéril 1 ó 2 colonias, emulsionándolas (no muy vigorosamente por la posible formación de aerosoles) y extendiendo en una fina capa con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire.
         
· Fijación:  La extensión puede fijarse con calor o metanol:
                    -
Calor:   se realiza sobre superficies calientes (hasta 60ºC) por paso directo de 2 a 3 veces a través de la llama, o por adición de unas gotas de alcohol sobre porta y posterior encendido hasta extinción de la llama. Evitar lo posible el sobrecalentamiento. Esperar a que el porta se enfríe antes de su tinción.
                    -
Metanol:   previene la lisis de hematíes y resulta en un más claro fondo. También evita el probable arrastre de la extensión de muestras de orina, semen, líquidos centrifugados en la etapa de lavado de la tinción. La técnica consiste en secar la extensión al aire, añadir unas gotas de metanol sobre ésta durante 1 minuto, decantándolo sin lavado y dejando secar la extensión otra vez al aire. No utilizar el calor en ningún momento.
         
· Tinción:   existen varias modificaciones de ésta según reactivos recomendados, tiempos de tinción y usos para la que se destine. Tradicionalmente se han venido aplicando las 3 siguientes:
                    -
Bacteriología en general:   se 1 min el cristal violeta, 1 min la solución iódica de Gram (lugol + bicarbonato sódico diluido), de 1 a 5 seg. la solución decoloradora de alcohol-acetona (1:1), y 30 seg. la safranina o fucsina básica al 0,1-0,2%.  A tener en cuenta que los tiempos de decoloración son el paso crítico. 

2. Coloración de Ziehl Neelsen:


La tinción de Ziehl Neelsen fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes.

Esta técnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

La técnica de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor.

Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.

        Coloración:
  Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5 cm entre una y otra, una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloración.
  Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el número de baciloscopias a colorear es pequeño, se puede filtrar la fucsina directamente cuando se la deposita sobre el extendido a través de un pequeño embudo con papel de filtro.
  Colocar sobre el soporte las láminas fijadas conservando el orden numérico con el extendido hacia arriba y manteniendo una separación de al menos 1cm entre ellas.
  Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo los extendidos.
  Con la llama de un mechero calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar demasiado ni hacer hervir..
  En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
  En el término de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisión de vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a sus lípidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal.
  Con una pinza, levantar cuidadosamente la lámina portaobjetos desde el extremo más cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presión, con un frasco o un grifo. Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior.
  Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y así evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación.

        Decoloración:


  Cubrir la totalidad del extendido con solución decolorante y dejar actuar aproximadamente 3 minutos.
  Enjuagar con abundante agua a baja presión.
  Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y enjuagar nuevamente.
      Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

Coloración de fondo:


  Cubrir todo el extendido con solución de azul de metileno.
  Dejar actuar durante un minuto.
  Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión y limpiar parte inferior con un algodón si ha quedado coloreada.
  Observar si las láminas conservan la numeración clara y visible. Si no es así volver a numerarlas.
  Dejar secar las láminas a temperatura ambiente, apoyándolas en posición vertical en un soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

2. Coloración de Giemsa:

Es la segunda coloración en uso, luego de la tinción de Wright, y en importancia de las mezclas de Romanowsky. Es quizás la mejor modificación de este tipo de coloraciones para descubrir parásitos en la sangre, como en el caso de malaria (Plasmodium spp.) y tripanosomiasis (Trypanosoma cruzi). El colorante de Giemsa también da excelentes resultados para la tinción rutinaria de frotes sanguíneos. Cuando se va a teñir con este colorante, debe fijarse primero la muestra con metanol absoluto por un tiempo mínimo de tres minutos (cuando la preparación no incluye metanol). El colorante en solución nunca se utiliza de manera directa, por lo que se debe diluir con la solución amortiguadora en una proporción de 1:10 ó 1:20 y el tiempo de coloración podrá ser de 10 ó 20 minutos, respectivamente.


Técnica:

 Fijar el frotis con alcohol metílico de 3-4 minutos. En caso de que la preparación del colorante ya posea metanol, este paso queda obviado.

 Sumergirlo verticalmente en una solución de Giemsa preparada extemporalmente a partir de 1 volumen de la solución colorante más 9 volúmenes de solución tampón (pBs, pH 6.8) o bien en agua desionizada.

 Esperar durante 10-20 minutos.

 Lavar el frotis con abundante agua, directamente del chorro.

 Limpiar el dorso del portaobjetos con una gasa o algodón humedecido en alcohol para eliminar cualquier resto de colorante.



 Secar al aire y observar con el microscopio con el objetivo de inmersión.

Compartir con tus amigos:


La base de datos está protegida por derechos de autor ©composi.info 2017
enviar mensaje

    Página principal