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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Departamento de Genética
El gen doublesex de Sciara coprophila (Diptera, Nematocera, Sciaridae)

Tesis Doctoral presentada por



MERCEDES ÁLVAREZ GARCÍA

Madrid, 2009

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Departamento de Genética
El gen doublesex de Sciara coprophila (Diptera, Nematocera, Sciaridae)
Tesis Doctoral presentada por

MERCEDES ÁLVAREZ GARCÍA

Para optar al grado de doctora en Biología


VºBº Autora

Fdo: Mercedes Álvarez García

VºBº Director VºBº Codirectora

Fdo: Lucas Sánchez Rodríguez Fdo: Mª Fernanda Ruiz Lorenzo

VºBº Tutor

Fdo:

La determinación sexual es un proceso que se conoce bien en Drosophila melanogaster. La caracterización molecular de los genes implicados y su organización jerárquica han sido establecidas, lo que constituye el punto de partida para el aislamiento de genes homólogos en otras especies de insectos y estudiar así los distintos mecanismos de determinación sexual existentes. A pesar de las diferencias en la señal primaria que controla el sexo, según la hipótesis de Wilkins (Wilkins, 1995) existiría una convergencia en la cascada a nivel del gen que ocupa la última posición, el gen doublesex (dsx), que se transcribe en ambos sexos dando lugar a transcritos diferentes por un procesamiento alternativo. Se originan dos proteínas, DsxF y DsxM, que imponen, respectivamente, un desarrollo tipo hembra y tipo macho al regular de forma antagónica la transcripción de los genes de cito-diferenciación sexual. En esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el aislamiento y la caracterización de un gen en Sciara coprophila (Scdsx) homólogo al gen doublesex (dsx) encontrado en otros insectos.



El gen Scdsx está formado por cuatro exones y tres intrones, y se transcribe, durante todo el desarrollo en los dos sexos dando lugar a cuatro productos de distinto tamaño por un procesamiento alternativo no específico de sexo. El transcrito mayoritario en machos codificaría una proteína putativa, ScDsxM221, de 221 aminoácidos, que carece de la región común del dominio OD2 presente en todas las proteínas DsxM caracterizadas hasta el momento. El transcrito más abundante en hembras codifica una proteína, ScDsxF273, de 273 aminoácidos, homóloga a la proteína DsxF de otros insectos. Las otras dos proteínas tipo hembra están muy poco representadas y se corresponden con proteínas ScDsxF273 truncadas.

El transcrito primario de Scdsx sigue los dos patrones alternativos, de hembra y de macho, en los dos sexos, aunque la efectividad de estos dos patrones si parece ser específica de sexo, lo cual requeriría de la existencia de factores específicos, en hembras o en machos, que determinasen esas diferencias sexuales en la efectividad de los dos tipos del procesamiento. Al contrario de lo que ocurre en otros dípteros, en Sciara el procesamiento del transcrito primario del gen dsx es independiente de la proteína Transformer.

Mediante la generación de un anticuerpo policlonal específico contra la región carboxilo-terminal de la proteína ScDsxF273 hemos determinado que dicha proteína está presente en cantidades similares en los dos sexos, durante todo el desarrollo y la vida adulta. Hemos generando un anticuerpo policlonal contra la región carboxilo-terminal específico de la proteína ScDsxM221. Sin embargo, no hemos podido detectar su presencia ni en hembras ni en machos.

Hemos producido moscas de Drosophila melanogaster transgénicas para las proteínas ScDsxF273 y ScDsxM221. Hemos determinado que ScDsxF273 y ScDsxM221 activan y reprimen, respectivamente, los genes de las vitelogeninas de la misma forma que lo hacen las propias proteínas DsxF y DsxM, respectivamente, de Drosophila.

Con respecto a la organización molecular, el gen dsx de Sciara comparte características encontradas en el gen dsx de los otros insectos y posee características propias.

Colectivamente, todos estos resultados sugieren que el gen dsx no tendría el papel clave discriminatorio de la determinación sexual en Sciara, al contrario de lo que ocurre en los insectos donde dsx ha sido caracterizado; y que la organización molecular del gen dsx de Sciara podría representar la organización mas próxima a la organización ancestral conocida de este gen en los insectos, de la cual evolucionarían los otros ortólogos de dsx.



ÍNDICE

1 Aislamiento y organización molecular del gen dsx de S. coprophila 62

1 Análisis comparativo de las proteínas Dsx de Sciara y otros insectos 96

1 MATERIALES 33

1.1 Mantenimiento de S. coprophila y S. ocellaris 33

1.2 Mantenimiento de D. melanogaster 33

1.3 Productos 33

1.4 Medios de cultivo y Soluciones 33

2 Las proteínas DsxF y DsxM de S. coprophila y su comparación con las proteínas Dsx de otros insectos. 66

2 MÉTODOS 34

2 Regulación del procesamiento del transcrito primario del gen dsx de Sciara 98

2.1 Extracción de ADN genómico 34

2.10 Extracción de ARN total 36

2.11 Purificación de ARN poliadenilado 36

2.12 Retrotranscripción (RT) 36

2.13 Secuenciación de ADN 37

2.14 Análisis de Secuencias 37

2.15 Análisis de los posibles sitios de procesamiento 37

2.16 Análisis del sitio de inicio de la transcripción 37

2.17 RT-PCR con oligonucleótidos degenerados 37

2.18 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 38

2.19 Genome Walker (Paseo Cromosómico) 38

2.2 Extracción de ADN plasmídico 34

2.20 Long PCR 39

2.21 Southern Blot 40

2.23 Cuantificación de la expresión del gen Scdsx en larvas de S. coprophila mediante RT-PCR 41

2.24 RT-PCR con cebadores específicos del gen Scdsx 42

2.26Construcción de los elementos trangénicos MSc y FSc 43

2.27 Construcción del elemento transgénico DScmg 44

2.28 Generación de moscas transgénicas 46

2.29 Comprobación de la presencia de los transgénes MSc, FSc y DScmg en moscas de D. melanogaster transgénicas 46

2.3 Digestión de ADN con endonucleasas de restricción 34

2.30 Localización cromosómica de los transgenes 47

2.31 Expresión del gen yolk protein 2 47

2.32 Expresión de los transgénes MSc#1 y MSc#2 48

2.33 Análisis del procesamiento 49

2.34 Generación de anticuerpos policlonales 50

2.35 Síntesis de los péptidos 50

2.36 Inmunización de los conejos 50

2.37 Obtención de los sueros 50

2.38 ELISA (\ 51

2.39 Dot Blot 51

2.4 Marcaje de sondas (32P dCTP 34

2.40 Preadsorción del anticuerpo anti-DsxF de S. coprophila 51

2.42 Comprobación de la especificidad del anticuerpo \“anti-DsxF\ 52

2.43 Patrón de expresión de la proteína ScDsxF273 durante el desarrollo de S. coprophila mediante electroforesis SDS-PAGE y Western Blot 54

2.44 Cuantificación de la expresión de la proteína ScDsxF273 en larvas de S. coprophila mediante electroforesis SDS-PAGE y Western Blot 54

2.5 Electroforesis en geles de agarosa 34

2.6 Amplificación de fragmentos de ADN mediante PCR (\“Polimerase Chain Reaction\ 35

2.7 Clonaje de productos de PCR 35

2.8 Comprobación de las colonias por PCR 35

2.9 Comprobación de las colonias mediante \“cracking\ 36

3 El gen dsx de S. coprophila es un gen de copia única 72

3 Expresión del gen dsx de Sciara 99

4 Función del gen dsx en la determinación sexual de S. coprophila 101

4 Los transcritos ScdsxF (tipo hembra) y ScdsxM (tipo macho) se encuentra en los dos sexos de S. coprophila 74

4.1 El gen dsx produce solamente proteína DsxF en ambos sexos 102

4.1 El gen Sex-lethal 19

4.2 El gen dsx produce las proteína DsxF y DsxM en ambos sexos 103

4.2 El gen transformer 20

4.3 El gen transformer2 21

4.4 El gen doublesex 21

4.5 El gen fruitless 24

4.6 El gen intersex 25

5 Evolución molecular del gen dsx en los insectos 105

5 Mecanismos de determinación sexual en Sciara 25

5 Patrón de expresión del gen dsx de S. coprophila 77

6 Expresión de las proteínas DsxF y DsxM de S. coprophila 79

6.1 La proteína DsxF de S. coprophila 80

6.2 La proteína DsxM de S. coprophila 82

7 Regulación del procesamiento del transcrito primario del gen dsx de S. coprophila 83

8 Efecto del gen dsx de S. coprophila en la síntesis de vitelogeninas de D. melanogaster 90

9 El gen dsx de S. ocellaris 93

ABREVIATURAS 5

AISLAMIENTO DEL GEN dsx DE S. ocellaris 42

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN dsx DE S. coprophila 37

Anexos 124

Bibilografía 110

Conclusiones 108

Discusión 95

Introducción 8

1 Mecanismos de determinación sexual en insectos 9

2 La base genética de la determinación sexual en Drosophila melanogaster 11

3 El gen doublesex de Drosophila melanogaster 14

3 El gen doublesex de Drodophila melanogaster

3.3 Función 17

3 El gen doublesex de Drosophila melanogaster

3.2 Proteínas DsxM y DsxF 16

4 Genes de la determinación sexual en otros insectos 19

El gen doublesex de Drosophila melanogaster

3.1 Procesamiento alternativo 15

Materiales y Métodos 32

MOSCAS TRANSGÉNICAS DE D. melanogaster 42

Objetivos 30

Resultados 61

TÉCNICAS MOLECULARES DE PROTEÍNAS 50

.2.22 Expresión del gen Scdsx mediante RT-PCR 40



ABREVIATURAS
32P-dCTP: desoxi-citidina trifosfato marcada con 32P

g: microgramo

l: microlitro

M: micromolar



aa: aminoácido

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario

Ala: alanina

arm: armadillo

Arg: arginina

ARN: ácido ribonucleico

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ARNt: ácido ribonucleico total

BSA: seroalbúmina bovina (bovine serum albumine)

ºC: grados centígrados

CyO,Cy: alelo mutante del gen Curly-o

Cys: cisteina

dNTP: desoxinucleótido trifosfato

dsx: doublesex

dsx1: alelo mutante del gen doublesex

DsxRE: elemento repetido de doublesex (doublesex repeat element)

EDTA: ácido etilendiamintetraacético

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay

FBE: potenciador del cuerpo graso (fat body enhancer)

fru: fruitless

g: gramo

Gal: galactosidasa

Gly: glicina

His: histidina

Hs: choque térmico (heat shock)

IgG: inmunoglobulina G

IPTG: isopropil -D-1-tiogalactopiranósido

ix: intersex

Kb: kilopares de bases

KDa: kiloDalton

l: litro

LB: medio de Luria-Bertani

M: molar

mg: miligramo

MgCl2: cloruro de magnesio

ml: mililitro

mM: milimolar

ng. nanogramo

ORF: marco abierto de lectura (open reading frame)

PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida (polyacrilamide gel electrophoresis)

pb: par de bases

PCR: reacción de la polimerasa en cadena (polymerase chaín reaction)

PBS: tampón fosfato salino

PBST: tampón fosfato salino con 0.1% de Tween-20

PMSF: fenilmetilsulfonil fluoruro

poli-A: ácido poliadenílico

poli-U: ácido poliuracílico

PRE: potenciador rico en purinas (purine rich enhancer)

RACE: amplificación rápida de los extremos de ADNc (rapid amplification cDNA ende)

rpm: revoluciones por minuto

RT: retrotranscripción

Sb: alelo mutante del gen Stuble

SDS: dodecil sulfato sódico (sodium dodecyl sulfate)

SSC: citrato sódico salino

Sxl: Sex-lethal

TBE: tampón tris bórico EDTA

TE: tampón tris EDTA

Tris: Tris(hidroximetil)amino-metano

tra: transformer

tra-2: transformer-2

U: unidad

UTR: región no traducida (untranslated region)

w: alelo mutante del gen white

w+: alelo silvestre del gen white

y: alelo mutante del gen yellow

yp: vitelogenina (yolk protein)

Introducción

La perpetuación de las especies a través de la reproducción sexual es la regla general dentro del Reino Animal. Machos y hembras son diferentes desde el punto de vista morfológico, fisiológico y de conducta. Este diformismo sexual es debido a la integración de dos procesos: determinación sexual y diferenciación sexual. La determinación sexual es el proceso que hace que el embrión siga un desarrollo de macho o de hembra. Los genes responsables se denominan genes de determinación sexual. La diferenciación sexual hace referencia a la expresión de los genes de citodiferenciación, controlados por los genes de determinación sexual, cuya expresión da lugar a la formación de las estructuras sexuales dimórficas que caracterizan a hembras y machos adultos.



1 Mecanismos de determinación sexual en insectos

Existen distintos mecanismos de determinación sexual en el Reino Animal, estando todos ellos representados en los insectos. No obstante, estos mecanismos pueden englobarse en tres tipos básicos en función de cual sea la señal primaria que determine el sexo: constitución cromosómica o genética del cigoto, efecto materno y condiciones ambientales.

La determinación sexual puede estar determinada por la constitución cromosómica del cigoto. Este mecanismo implica diferencias cromosómicas, de tal forma que un sexo es homomórfico y el otro sexo es heteromórfico para los cromosomas sexuales. Así, hay insectos en los que las hembras son el sexo homomórfico (XX) y los machos son el sexo heteromórfico (XY). El ejemplo más representativo de esta situación tiene lugar en Drosophila melanogaster (la mosca del vinagre), donde la determinación sexual está basada en la razón entre el número de cromosomas X y el número de juegos haploides de autosomas, siendo las hembras 2X;2A y los machos X;2A (X hace referencia al cromosoma X y A hace referencia al complemento haploide de autosomas). En otras especies, el sexo heteromórfico es portador de un factor determinante de macho que puede estar localizado en el cromosoma Y, como es el caso de los trefrítidos Ceratitis capitata (la mosca mediterránea de la fruta), Bactrocera oleae (la mosca del olivo) y Anastrepha obliqua (la mosca de la fruta) o de Musca domestica (la mosca doméstica), si bien en esta última, el factor de masculinidad puede encontrarse en un autosoma. Sin embargo, existen también insectos, como los lepidópteros, en los que ocurre lo contrario, constituyendo los machos (ZZ) el sexo homomórfico y las hembras (ZW) el sexo heteromórfico. En otros casos, las diferencias cromosómicas son debidas a la existencia de un sistema haplo-diploide como es el caso de Apis mellifera (la abeja), siendo las hembras diploides y los machos haploides.

En la mayoría de las especies, entre las que se incluyen las mencionadas, la constitución cromosómica del cigoto es consecuencia directa de la constitución cromosómica de los gametos (Bull, 1983). Sin embargo, en otras especies, las diferencias cromosómicas responsables de determinar el sexo son consecuencia del comportamiento especializado de los cromosomas sexuales en los primeros estadíos del desarrollo embrionario. En las especies de dípteros de Sciara (mosquito del hongo), todos los cigotos comienzan con una constitución cromosómica 3X;2A (donde dos cromosomas X provienen del padre y un cromosoma X de la madre). Se produce, en estos, una eliminación diferencial de los cromosomas sexuales. La pérdida de un cromosoma X paterno origina un cigoto 2X;2A que dará lugar a una hembra, mientras que la pérdida de los dos cromosomas X paternos origina un cigoto X0;2A que dará lugar a un macho. En los cóccidos (la cochinilla), tanto la eliminación diferencial de los cromosomas paternos, como la heterocromatinización de los mismos, originan cigotos diploides o haploides que se desarrollarán en hembras o machos, respectivamente.

A nivel genético, el sexo puede estar controlado por un único locus o por varios loci (Bull, 1983). Un ejemplo es la abeja, donde un único locus con varios alelos, llamado Complementary Sex Determination (CSD), determina el sexo del cigoto. Las hembras son siempre heterocigotas para este locus mientras que los machos pueden ser homocigotos (estériles) o hemicigotos (fértiles), y por tanto, haploides (Beye et al., 2003).

Un ejemplo de determinación sexual debida a un efecto materno ocurre en Chrysomya rufifacies (la mosca azul o mostarda), donde el sexo del cigoto es determinado exclusivamente por el genotipo de la madre. En esta especie existen dos tipos de hembras. Las hembras ginogénicas son heterocigotas para un gen F, que codifica un factor materno que es depositado en los oocitos durante la oogénesis y que impone el desarrollo de hembra a los cigotos derivados de este oocito. Por tanto, estas hembras sólo producen hembras en su descendencia. Las hembras androgénicas, al igual que los machos, son homocigotas para el alelo recesivo f, que no produce factor materno, por lo que sólo producen machos en su descendencia.

Finalmente, los factores ambientales pueden ser los responsables de determinar el sexo. Es conocido el efecto de la temperatura en algunas especies de ciáridos, donde la razón sexual (machos versus hembras) puede desviarse del valor 1 que toma a nivel poblacional.

Todos estos mecanismos se dan en los insectos, por lo que constituyen un modelo experimental adecuado para el estudio evolutivo de dichos mecanismos. En Sciara los tres tipos de mecanismos se dan de forma concatenada, por lo que este organismo representa un modelo clave para el estudio integrado de los distintos mecanismos de determinación sexual que han ido apareciendo a lo largo de la evolución.



2 La base genética de la determinación sexual en Drosophila melanogaster

El sistema de determinación sexual de referencia es el que presenta D. melanogaster ya que ha sido rigurosamente analizado. Las relaciones epistáticas existentes entre los genes de determinación sexual revelan que están organizados jerárquicamente (Figura 1), de modo que el producto de un gen controla el procesamiento específico de sexo del pre-ARNm del gen que se encuentra por debajo en la cascada (Sánchez et al., 2005). El gen Sex-lethal (Sxl) ocupa la posición superior en la cascada de determinación sexual; su producto controla el procesamiento de su propio pre-ARNm, así como el procesamiento del pre-ARNm del gen transformer (tra). La proteína Tra junto con el producto constitutivo del gen transformer2 (tra2) controlan el procesamiento específico de sexo del pre-ARNm del último gen en la cascada, doublesex (dsx), que se transcribe en ambos sexos dando lugar a proteínas diferentes, DsxM y DsxF.

La señal primaria que determina el sexo es la señal X;A (razón entre el número de cromosomas X y el número de juegos haploides de autosomas). En individuos 2X;2A esta señal X;A tiene un valor de 1, lo que determina el desarrollo de hembra, mientras que en individuos 1X;2A la señal X:A tiene un valor de 0.5, lo que determina el desarrollo de macho (Cline, 1993).

Figura 1. Cascada genética de la determinación sexual en D. melanogaster. SxlF y SxlM indican proteína Sxl funcional y no funcional, respectivamente. TraF y TraM indican proteína Tra funcional y no funcional, respectivamente. DsxF y DsxM indican proteína Dsx funcional de hembra y macho, respectivamente. FruM indica proteína Fru funcional específica de macho. En los machos, el valor de 0.5 de la señal X;A, conlleva a que se produzcan por defecto las proteínas SxlM, TraM, DsxM y FruM. En hembras, la señal X;A tiene un valor de 1 y se producen proteínas SxlF, TraF y DsxF. Las proteínas Tra-2, Ix y Her son producidas en ambos sexos. SNC hace referencia al sistema nervioso central (Sánchez, 2008).

El gen Sex-lethal (Sxl) tiene dos promotores, un promotor temprano y un promotor tardío (Salz et al., 1989). En respuesta a la señal X;A se activa, sólo en los cigotos 2X;2A, el promotor temprano del gen, lo que da lugar a la formación de proteína Sxl temprana sólo en hembras. Una vez se llega al estadío de blastodermo, la señal X;A ya no se necesita y queda fijada la actividad de Sxl (Sánchez and Nöthiger, 1983; Bachiller and Sánchez, 1991) gracias a su capacidad de autorregulación. Esta capacidad de autorregulación positiva, por medio de la cual la proteína Sxl participa en el procesamiento de su propio transcrito primario, proporciona la memoria celular para el desarrollo de hembra (Cline, 1984).

Más tarde en el desarrollo, después del blastodermo, se activa el promotor tardío de este gen en ambos sexos, produciéndose transcrito tardío de Sxl durante el resto del desarrollo y la vida adulta. Los transcritos tardíos de los machos son idénticos a los de las hembras, excepto por la presencia en ellos de un exón (L3) adicional que contiene un codón de parada de la traducción, produciendo una proteína Sxl truncada. En hembras, se produce un procesamiento alternativo debido a la unión de la proteína Sxl temprana a secuencias de polipirimidinas (poli-U) localizadas en los intrones 2 y 3 que flanquean al exón específico de macho (L3), produciéndose un ARNm que no presenta dicho exón y que, por tanto, origina proteína Sxl tardía funcional (Bell et al., 1988).

El gen tra se transcribe en machos y hembras, pero su transcrito primario sigue un procesamiento alternativo específico de sexo. El pre-ARNm del gen tra tiene dos sitios 3’ de procesamiento alternativo en el intrón 1, uno específico de hembra (distal) y otro no específico de sexo (proximal). Cuando éste último es usado, se genera un transcrito que contiene un codón de parada de la traducción dentro del marco abierto de lectura, generándose, por tanto, una proteína Tra truncada y no funcional. En hembras, debido a la presencia de la proteína Sxl, que compite con el factor de procesamiento U2AF (U2 auxiliary factor) por unirse al tracto de poli-U del sitio 3’proximal, aproximadamente la mitad del pre-ARNm de tra es procesado de forma diferente. El factor U2AF, al no poder unirse al sitio 3’proximal, se va a unir al tracto de polipirimidinas del sitio 3’distal, específico de hembra, por el que presenta una menor afinidad. De esta forma, el codón de parada de la traducción no es introducido y se origina una proteína Tra completa y funcional (Boggs et al., 1987; Belote et al., 1989; Valcárcel et al., 1993). La proteína Tra junto con el producto del gen constitutivo transformer2 (tra2) controla el procesamiento específico de sexo del pre-ARNm del gen doublesex (dsx).

El gen dsx es el último gen de la jerarquía genética que controla la determinación sexual. Se transcribe en ambos sexos dando lugar a transcritos diferentes. Como consecuencia, se obtienen dos proteínas, ambas funcionales: DsxM, en machos, y DsxF, en hembras, que tienen una función antagónica en la regulación transcripcional de genes responsables de la diferenciación sexual terminal.

La proteína Tra junto con el producto constitutivo del gen tra2 controla también el procesamiento alternativo específico de sexo del pre-ARNm del gen fruitless (fru). Este gen, al igual que dsx, está involucrado en el desarrollo sexual masculino del sistema nervioso central (Rideout et al., 2007) requerido para el cortejo en los machos (Shirangi et al., 2006). El gen fru es un gen complejo que presenta cuatro promotores. Se transcribe en ambos sexos generando distintos tipos de transcritos por procesamiento alternativo de su transcrito primario. El promotor P1 únicamente funciona en un grupo reducido de neuronas del sistema nervioso central, en varias regiones del cerebro, y en el ganglio ventral (Billeter et al., 2002; 2006). El procesamiento alternativo del pre-ARNm transcrito a partir de este promotor está regulado por el complejo Tra-Tra2. En las hembras, la unión de este complejo al pre-ARNm determina la incorporación de un exón específico de hembra que tiene codones de parada de la traducción, generándose una proteína Fru no funcional. En machos, donde la proteína Tra no está presente, el exón específico de hembra no se incorpora. Se produce, entonces, proteína FruM funcional (Ryner et al., 1996; Heinrichs et al., 1998; Goodwin et al., 2000). Los promotores P2-P4 funcionan en tejidos neuronales y no neuronales en estadíos embrionarios y codifican proteína funcional en ambos sexos.

El gen hermaphrodite (her) tiene una dualidad de función. Su expresión materna es necesaria para la activación temprana de Sxl, mientras que su expresión cigótica es necesaria para la diferenciación terminal de hembra y algunos aspectos de la diferenciación terminal de macho (Pultz and Baker, 1995; Li and Baker, 1998).

El gen intersex (ix) se transcribe en ambos sexos dando lugar a un pre-ARNm que no sigue un procesamiento específico de sexo, por lo que la proteína Ix está presente en machos y en hembras. Se ha demostrado la interacción de esta proteína con DsxF, pero no con DsxM, formándose un complejo con capacidad de unión al ADN que estaría implicado en la activación de los genes de diferenciación sexual de hembra (Chase and Baker, 1995; Waterbury et al., 1999; Garrett-Engele et al., 2002).



3 El gen doublesex de Drosophila melanogaster

El gen dsx está compuesto por seis exones y se transcribe en ambos sexos dando lugar a transcritos diferentes por un procesamiento alternativo. Los tres primeros exones son comunes en machos y hembras, mientras que el exón 4 es específico de hembra y los exones 5 y 6 son específicos de macho. En machos, debido a la ausencia de proteína Tra, el procesamiento tiene lugar, por defecto, produciéndose el mensajero que codifica la proteína DsxM, que determina el desarrollo sexual de macho (Burtis and Baker, 1989; Hoshijima et al., 1991). El procesamiento tipo hembra produce un mensajero que codifica la proteína DsxF, responsable del desarrollo sexual femenino (Hedley and Maniatis, 1991; Inoue et al., 1992; Tian and Maniatis, 1993). Las proteínas DsxM y DsxF son factores de transcripción que presentan una región amino terminal común y una región carboxilo terminal específica (Figura 2).



Figura 2. Estructura y patrón de expresión del gen dsx de D. melanogaster. Los rectángulos coloreados representan los exones: en verde los exones comunes a ambos sexos, en rojo el exón específico de hembra y en azul los exones específicos de macho. Las regiones 5´UTR y 3´UTR se representan en un tono más claro. Se indican los codones de inicio y parada de la traducción, los sitios de poliadenilación (AAA) y los dominios OD1 y OD2. Las líneas de color negro representan los intrones. (A) Organización molecular del gen. El procesamiento del pre-ARNm se representa con líneas de color rojo, procesamiento tipo hembra, y azul, procesamiento tipo macho. (B) Transcritos específicos de hembra y de macho resultado del procesamiento alternativo. (C) Esquema de las proteínas DsxF y DsxM.

3.1 Procesamiento alternativo


En las hembras, la proteína Tra, presente sólo en este sexo, forma un complejo con la proteína Tra-2, de carácter constitutivo (Amrein et al., 1988; Mattox et al., 1991). Ambas proteínas tienen dominios SR (Serina/Arginina) y van a reclutar a otros factores generales de procesamiento de esta familia de proteínas SR por medio de la interacción entre estos dominios. La proteína Tra2, así como las proteínas SR, tienen también dominios RRM (dominio de reconocimiento de ARN), que no se han encontrado en la proteína Tra. Por ello, aunque Tra es un componente esencial, no parece contactar directamente con el ARN (Sciabica et al., 1996).

Así, el complejo Tra-Tra2 interacciona con la proteína RBP1, proteína SR, y se une, en la primera mitad del exón 4 del pre-ARNm del gen dsx, al elemento DsxRE (doublesex repeat element) y al elemento PRE (purine-rich element), reclutando al factor de procesamiento U2AF y a otros componentes de la maquinaria general de procesamiento (Figura 3). El potenciador DsxRE, formado por seis repeticiones de una secuencia de 13 nucleótidos (UC(U/A)(U/A)C(A/G)AUCAACA), se encuentra situado a 300 nucleótidos aguas abajo del sitio 3´ de procesamiento del intrón 3, y el elemento PRE entre las repeticiones 5 y 6 de este potenciador. Como consecuencia, este sitio 3´ de procesamiento del intrón 3, que es un sitio débil porque su secuencia se aleja de la consenso, es reconocido en lugar del sitio 3’ de procesamiento del intrón 4, y el exón 4 es incorporado al ARNm. Por medio de este procesamiento tipo hembra, se origina la proteína DsxF, de 427 aminoácidos, responsable del desarrollo sexual femenino. En los machos, debido a la ausencia de Tra, el procesamiento tiene lugar, por defecto, usándose el sitio 3’ del intrón 4, no incorporándose el exón 4 al ARNm y sí los exones 5 y el 6, originándose la proteína DsxM, de 549 aminoácidos, que determina el desarrollo sexual de macho.


3.2 Proteínas DsxF y DsxM


Las proteínas DsxF y DsxM tienen dos dominios de oligomerización (OD). El domino OD1 está localizado en la región amino terminal común de ambas proteínas y contiene un dominio DM (Doublesex y Mab-3), de unión a ADN, con seis aminoácidos (Cys, His, His, Cys, Cys y Arg) sin los cuales dicha unión no puede producirse. Tiene una estructura de dedo de zinc que no se corresponde con ninguna de las tres clases de este tipo de dominios de unión a ADN, debido a que, aunque posee pares de cisteína e histidina separados por una región de residuos hidrofóbicos, éstos no están en la posición canónica (Harrison, 1991). La secuencia consenso de ADN a la que se unen las proteínas Dsx está formada por 13 nucleótidos: (G/A)NNAC(A/T)A(T/A)GTNN(C/T). Esta secuencia forma un palíndromo de seis nucleótidos (G/A)NNAC(A/T) alrededor del par de bases central (Erdman et al., 1996).

Figura 3. Procesamiento alternativo del pre-ARNm del gen dsx de D. melanogaster. Los rectángulos coloreados representan los exones: en verde el exón 3 común a ambos sexos en rojo el exón 4 específico de hembra y en azul el exón 5 específico de macho. Se indican el codón de parada de la traducción y el dominio OD2. Las líneas de color negro representan los intrones. El procesamiento del pre-ARNm se representa con líneas de color rojo, procesamiento tipo hembra, y azul, procesamiento tipo macho. Dentro del exón específico de hembra se señalan los sitios de unión de Tra-Tra2: en amarillo se representa los potenciadores DsxRE y en morado el elemento PRE. El complejo Tra-Tra2 activa el sitio 3´ de procesamiento (3’ss) del intrón que precede al exón 4 específico de hembra .

El dominio OD2, que permite la unión a proteínas de la maquinaria transcripcional, presenta una región que es común a DsxF y DsxM, y una región específica de sexo que únicamente está presente en la región carboxilo terminal de la proteína DsxF. La región común del dominio OD2 tiene una estructura de hélice alfa con una región anfipática que constituye la base molecular de las interacciones proteína-proteína. El extremo carboxilo terminal de ambas proteínas tiene también estas características anfipáticas. De esta forma, puede producirse la homodimerización y la heterodimerización de Dsx. El dominio específico de DsxF es esencial para su función (Erdman et al., 1996).


3.3 Función


DsxF y DsxM tienen una dualidad funcional antagónica en la regulación transcripcional de genes responsables de la diferenciación sexual terminal. DsxM previene la expresión de genes específicos de la diferenciación de hembra, mientras que participa en la expresión de los genes de diferenciación de macho. DsxF, en cambio, previene la expresión de éstos genes, mientras que interviene en la expresión de los genes específicos de la diferenciación sexual de hembra (Jurnisch and Burtis, 1993; Sánchez et al., 2001; Keisman et al., 2001).

La función de Dsx mejor caracterizada a nivel molecular es la regulación de la expresión de los genes de las vitelogeninas (yolk proteins genes, yps) responsables de proveer aminoácidos al embrión en desarrollo y transportar hormonas esteroideas, en su forma inactiva, al oocito, para ser liberadas durante la vitelogénesis. Se han identificado tres genes yps: yp1, yp2 e yp3, que codifican respectivamente para las glicoproteínas YP1, YP2 e YP3. Su síntesis tiene lugar en el cuerpo graso, estructura similar al hígado de vertebrados, de hembras adultas, y en las células foliculares de los ovarios. Las proteínas sintetizadas en el cuerpo graso son secretadas a la hemolinfa para ser transportadas al oocito, mientras que las sintetizadas en las células foliculares son secretadas unidireccionalmente hacia el oocito. Una vez en el oocito, quedan almacenadas en gránulos para su utilización en la embriogénesis. Los genes yp1 y yp2 están bajo el control de dsx en el cuerpo graso. Las proteínas Dsx ejercen su función mediante la unión a un potenciador de 127 nucleótidos, FBE (Fat Body Enhancer), situado entre ambos genes. DsxF activa los genes yps, mientras que DsxM los inhibe (Bownes, 1994). La represión ocurre porque DsxM se une directamente al FBE en los machos, interfiriendo la acción de este potenciador. Este mecanismo puede implicar la competición con proteínas activadoras por la unión a este sitio, la interacción directa con proteínas activadoras que causan su inactivación o la interferencia directa con proteínas de la maquinaria transcripcional (Burtis et al., 1991). En los individuos intersexuales, en los que ambas proteínas, DsxF y DsxM, pueden estar simultaneamente presentes o ausentes, los genes yps están desregulados y puede detectarse una expresión basal de los mismos (Bownes and Nöthiger, 1981). La expresión de los genes yps en las células foliculares no se encuentra bajo el continuo control de dsx. El ovario está preprogramado para sintetizar YPs en un determinado estadío del desarrollo, estadío 8-11 de la oogénesis. Así, los genes de la determinación sexual establecen el desarrollo apropiado de los órganos reproductores en machos y hembras a comienzos del desarrollo, pero no son requeridos para la expresión específica de genes en el tejido maduro. En el cuerpo graso, por el contrario, al estar presente en ambos sexos, sí que es necesaria una regulación posterior. El gen yp3 presenta unas secuencias, en su región 5’ no codificante, responsables de conferir su expresión en el ovario y en el cuerpo graso. Existen otros factores, además de la cascada de determinación sexual, que intervienen en la expresión de los genes yps y que contribuyen a que tenga lugar una correcta regulación sexual, temporal y espacial durante el desarrollo. Así, los nutrientes y dos hormonas que regulan la metamorfosis pueden influir en los niveles de YPs. La hormona juvenil y la ecdisona incrementan la síntesis de YPs en el cuerpo graso, mientras que en el ovario es sólo la ecdisona (Bownes, 1994).

4 Genes de la determinación sexual en otros insectos

El estudio de la evolución de los mecanismos que controlan la determinación sexual en los insectos ha sido abordado mediante el aislamiento en otros insectos (Figura 4) de los homólogos de los genes que controlan este proceso en D. melanogaster. La idea subyacente es determinar cómo ha podido cambiar la cascada de los genes de la determinación sexual a lo largo de la evolución, desde los insectos más primitivos a los insectos más evolucionados como son los drosofilidos. A continuación se resume el estado actual de este análisis.



4.1 El gen Sex-lethal

El gen Sxl ha sido caracterizado en otras especies de Drosophila: D. virilis (Bopp et al., 1996) y D. pseudoobscura (Penalva et al., 1996). Como en D. melanogaster, la regulación de Sxl ocurre por un procesamiento alternativo específico de sexo: el ARNm en machos tiene un exón adicional que contiene codones de parada de la traducción. En D. virilis, Sxl presenta, a continuación del último codón de parada de la traducción de este exón, otro marco abierto de lectura, generando una proteína Sxl que es idéntica a la de las hembras excepto por los primeros 25 amino ácidos de la región amino terminal. La proteína Sxl de macho es acumulada fundamentalmente en el ectodermo del embrión, lo que sugeriría un papel en el desarrollo del sistema nervioso central (Bopp et al., 1996). Esta misma proteína también ha sido detectada en otras especies (D. americana, D. flavomontana y D. borealis) (Bopp et al., 1996).

Fuera del género Drosophila, Sxl ha sido caracterizado en los dípteros Chrysomya rufifacies (Müller-Holtkamp, 1995), Megaselia scalaris (mosca fórido) (Sievert et al., 1997, 2000), Musca domestica (Meise et al., 1998) y los tefrítidos Ceratitis capitata (Saccone et al., 1998) y Bactrocera oleae (Lagos et al., 2005), pertenecientes al suborden Brachycera, y en Sciara ocellaris (Ruiz et al., 2003), Sciara coprophila, Rynchosciara americana y Trichosia pubescens (Serna et al., 2004), pertenecientes al suborden Nematocera. Sxl también ha sido caracterizado en el lepidóptero Bombyx mori (gusano de la seda) (Niimi et al., 2006). El gen Sxl de estas especies no muestra una regulación específica de sexo, produciéndose la misma proteína Sxl en machos y en hembras. Así, Sxl no parece jugar el papel clave en el control de la determinación sexual que tiene en los drosofilidos, lo que sugiere que Sxl ha adquirido esta función durante la evolución del linaje de Drosophila.



Figura 4. Clasificación de los insectos citados en esta tesis. En rojo se muestras las especies mencionadas. Esquema modificado de Sánchez, 2008.

4.2 El gen transformer

El gen tra ha sido caracterizado en las siguientes especies del género Drosophila: D. simulans, D. mauritiana, D. sechellia, D. erecta (O´Neil and Belote, 1992; Kulathinal et al., 2003), D. hydei y D. virilis. Su comparación con el gen tra de D. melanogaster revela un elevado grado de divergencia. El gen tra de D. virilis provee parcialmente la función tra+ en moscas de D. melanogaster mutantes para este gen (O´Neil and Belote, 1992).

Fuera de los drosofilidos, el gen tra ha sido caracterizado, en los tefrítidos C. capitata (Pane et al., 2002; 2005), B. oleae (Lagos et al., 2007) y en doce especies de Anastrepha: A. obliqua, A. ludens, A. serpentina, A. striata, A. bistrigata, A. grandis, A. amita, A. sororcula, A. sp1. aff. fraterculus, A. sp2. aff. fraterculus, A. sp3. aff. fraterculus y A. sp4. aff. Fraterculus (Ruiz et al., 2007). En todos estos tefrítidos, el gen tra muestra autorregulación positiva caracterizada por la función de la proteína Tra en el procesamiento de su propio transcrito primario, de modo que en hembras se produce proteína Tra funcional, mientras que en machos se produce proteína Tra truncada no funcional. Además, el gen tra de C. capitata (Pane et al 2005) y de Anastrepha obliqua (Ruiz y Sánchez, comunicación personal) provee parcialmente la función tra en moscas de D. melanogaster mutantes para este gen.

4.3 El gen transformer2

Se ha caracterizado el gen tra2 en D. virilis (Chandler et al., 1997) que codifica unas isoformas proteicas análogas a las de D. melanogaster.

Fuera del género Drosophila, tra2 ha sido caracterizado en M. domestica (Burghardt et al., 2005). Este gen se transcribe en los dos sexos y su función es requerida, tanto para el procesamiento específico de hembra del pre-ARNm del gen dsx, como para la actividad autocatalítica del gen F (Burghardt et al., 2005), gen clave en la determinación sexual de este insecto (Dübendorfer et al., 2002).

4.4 El gen doublesex

El gen dsx ha sido caracterizado en los dípteros M. scalaris (Sievert et al., 1997; Kuhn et al., 2000), M. domestica (Hediger et al., 2004), Anopheles gambiae (el mosquito) (Scali et al., 2005), B. tryoni (mosca de la fruta “Queensland”) (Shearman and Frommer, 1998), B. oleae (Lagos et al., 2005), B. dorsalis (la mosca de la fruta oriental) (Chen et al., 2008), C. capitata (Saccone et al., 2002) y en las once de las especies de Anastrepha antes mencionadas (Ruiz et al., 2007). El gen dsx también ha sido aislado en el himenóptero A. mellifera (Cho et al., 2007) y en el lepidóptero B. mori (Ohbayashi et al., 2001; Suzuki et al., 2001).

La organización molecular del gen varía entre estos insectos, pero en todos ellos dsx presenta un procesamiento alternativo específico de sexo, lo que da lugar a proteínas putativas Dsx específicas de macho y hembra, que, como en Drosophila, comparten el extremo amino terminal y difieren en el carboxilo terminal.







Figura 5. Estructura y patrón de expresión del gen dsx de D. melanogaster (A), A. gambiae (B), B. mori (C) y A. mellifera (D). Los rectángulos coloreados representan los exones: en verde los exones comunes a ambos sexos, en rojo los exones específicos de hembra y en azul los exones específicos de macho. Las regiones 5’UTR y 3’UTR se representan en un tono más claro. Se indican los codones de inicio y parada de la traducción, los dominios OD1 y OD2 y los sitios de unión del complejo Tra-Tra2 (punto negro). Las líneas de color negro representan los intrones. El procesamiento del pre-ARNm tipo hembra se representa con líneas de color rojo y el procesamiento tipo macho con líneas de color azul. (E) Relación filogenética existente y tiempo aproximado de divergencia de D. melanogaster , A. gambiae, B. mori y A. mellifera.

El mecanismo del procesamiento específico de sexo descrito para Drosophila, es aplicable al pre-ARNm dsx de los dípteros donde dicho gen se ha caracterizado. En estos dípteros se han encontrado sitios putativos de unión del complejo Tra-Tra2 en el exón específico de hembra. Esto sugiere que el procesamiento que tiene lugar por defecto es el de macho, mientras que el de hembra requiere la proteína Tra, que sólo está presente en este sexo. La unión del complejo Tra-Tra2 al exón específico de hembra determinaría que el sitio 3’ de procesamiento del intrón que precede a dicho exón, que es débil, participe en el procesamiento, incorporándose así dicho exón en el ARNm de hembra. Una excepción en los dípteros es el mosquito A. gambiae, donde el sitio 3´ de procesamiento que precede al exón específico de hembra del pre-ARNm de dsx no es un sitio débil de procesamiento. Pero al igual que ocurre en el resto de los dípteros, si existen secuencias putativas de unión de Tra-Tra2, localizadas cerca del extremo 3’ del exón específico de hembra, por lo que en el mosquito, la incorporación del exón específico de hembra parece ocurrir por activación del sitio 5’ de procesamiento del intron que sigue al exón específico de hembra (Scali et al., 2005), como ocurre con el pre-ARNm fruitless de Drosophila.

Al igual que ocurre en A. gambiae, el pre-ARNm de dsx del lepidóptero B. mori y del himenóptero A. mellifera no presenta un sitio débil 3´ de procesamiento específico de hembra. Sin embargo, al contrario de lo que ocurre en Anopheles, no se han identificado secuencias putativas de unión del complejo Tra-Tra2 (Suzuki et al., 2001; Cho et al., 2007). En B. mori, se ha visto que el procesamiento tipo hembra del pre-ARNm de dsx ocurre por defecto (Suzuki et al., 2001). Se ha identificado una proteína, BmPSI, que en los machos se une específicamente al exón 4 inhibiendo la incorporación de los exones 3 y 4 específicos de hembra en el ARNm (Suzuki et al., 2008)

A diferencia de otros insectos, en A. mellifera existen dos transcritos específicos de hembra que difieren en el sitio de terminación de la transcripción. El transcrito que se ha denominado F1 es igual al transcrito de macho excepto porque incorpora el exón específico de hembra. Es decir, es una situación que recuerda a la encontrada en B. mori y A. gambiae, donde los transcritos de macho y hembra comparten los dos exones finales. Por el contrario, el transcrito denominado F2 es diferente al transcrito específico de macho en la región 3’ terminal ya que no posee los dos exones específicos de macho. Se trata, por tanto, de una situación similar a la que tiene lugar en D. melanogaster y otros dípteros. Por último, se ha observado la presencia de pequeñas cantidades de transcrito específico de hembra en los machos, lo que sugiere que el procesamiento que puede tener lugar por defecto es el de hembra (Cho et al., 2007).



4.5 El gen fruitless

El gen fru se ha caracterizado en D. simulans, D. yakuba, D. pseudoobscura, D. virilis, D. suzukii (Billeter et al., 2002), A. gambiae y Tribolium castaneum (Gailey et al., 2006). En todos los casos, la estructura molecular del gen, así como la regulación del procesamiento por Tra-Tra2 responsable de generar la proteína FruM, están conservadas.



4.6 El gen intersex

El gen ix ha sido caracterizado en los dípteros D. virilis y M. scalaris, y en el lepidóptero B. mori (Siegal and Baker, 2005). La proteína Ix de estos insectos parece tener una organización conservada. La región amino terminal es rica en residuos de glutamina, prolina, glicina y serina. La región carboxilo terminal es rica en aminoácidos polares y presenta dos residuos conservados de fenilalanina los cuales parecen ser específicos de esta proteína. El gen ix de D. virilis y M. scalaris es capaz de rescatar la función en hembras mutantes de D. melanogaster para este gen, lo que sugiere que la proteína Ix de estos insectos puede interaccionar con DsxF de D. melanogaster, como ocurre con su propia proteína Ix. Sin embargo, el gen ix de B. mori sólo rescata parcialmente el desarrollo sexual femenino de hembras de D. melanogaster mutantes para ix. Esto sugiere que las proteínas DsxF e Ix de ambas especies han coevolucionado y divergido (Siegal and Baker, 2005).



5 Mecanismos de determinación sexual en Sciara

En Sciara se dan los tres mecanismos básicos que producen la señal primaria que determina el desarrollo sexual que seguirá el cigoto. Estos mecanismos, que aparecen en la mayoría de las especies animales como mecanismos únicos, se dan en Sciara relacionados entre si y de forma concatenada: condiciones ambientales>factor materno> constitución cromosómica.

En la mayoría de las especies el sexo del individuo queda fijado con la fecundación. Sin embargo, en algunos casos las diferencias cromosómicas que determinan el sexo son debidas al comportamiento especial del cromosoma X en los primeros estadíos de desarrollo embrionario. Es el caso de los dípteros de la familia Cecidomyiidae (White, 1973; Stuart and Hatchett, 1991) y Sciaridae (DuBois, 1933; Metz, 1938), pertenecientes al suborden Nematocera.

El complemento cromosómico ordinario de Sciara presenta tres pares de autosomas (cromosomas II, III y IV) y uno o dos cromosomas X dependiendo de si se trata de un macho o de una hembra, respectivamente. La especie S. coprophila posee, además, unos cromosomas de naturaleza heterocromática denominados cromosomas L (germline-limited), que son específicos de la línea germinal y se eliminan en las células somáticas, tanto en las hembras como en los machos. En Sciara las hembras son 2X;2A mientras que los machos son X0;2A (Gerbi, 1986). Es decir, al igual que en D. melanogaster, la señal primaria que determina el sexo parece ser la razón entre el número de cromosomas X y el número de juegos haploides de autosomas (razón X;A). Sin embargo, existe una diferencia en el modo en que se forma dicha señal. En Drosophila, la constitución cromosómica de los embriones (2X;2A ó XY;2A) es consecuencia directa de la constitución cromosómica de los gametos (los oocitos son 1X;1A y los espermatozoides X;1A ó Y;1A). En Sciara, sin embargo, dicha constitución cromosómica es consecuencia de un proceso de eliminación del cromosoma X. Todos los cigotos comienzan su desarrollo siendo 3X;2A (los oocitos son 1X;1A y los espermatozoides 2X;1A). Durante las primeras divisiones embrionarias, todas las células somáticas eliminan todos los cromosomas L y uno o dos cromosomas X de origen paterno, lo que determinará, respectivamente, la constitución XXAA de hembras o X0AA de machos (Gerbi, 1986; Goday and Esteban, 2001) (Figura 6). Por tanto, en los ciáridos, en la formación de la señal cromosómica X:A se da un proceso de impronta cromosómica que determina que los cromosomas que van a ser eliminados sean los de origen paterno. Por otro lado, el número de cromosomas X eliminados en el embrión está controlado por un factor citoplásmico de origen materno, depositado en el oocito durante la oogénesis, y cuya naturaleza se desconoce (Metz 1938; de Saint-Phalle and Sullivan, 1996; Sánchez and Perondini, 1999).

En etapas embrionarias más tardías, al comienzo de la segmentación de la banda germinal, todos los núcleos germinales de ambos sexos eliminan uno de los dos cromosomas X paternos. Si bien, la meiosis femenina es ortodoxa, en las células germinales masculinas se produce otro evento de eliminación de cromosomas. Durante la meiosis I todo el complemento cromosómico paterno es excluido del espermatocito en una vesícula citoplásmica. En la meiosis II, las cromátidas de los autosomas y de los cromosomas L segregan normalmente, pero el cromosoma X materno no realiza la disyunción de las cromátidas hermanas, por lo que el núcleo del espermatozoide contiene dos cromosomas X de origen materno. Así, los cromosomas X paternos que son eliminados en cada generación son de origen materno, por lo que la marca de la impronta genómica, que determina los cromosomas que van a ser eliminados, es borrada en cada generación.



Figura 6. Diagrama del ciclo cromosómico de Sciara coprophila. “A” representa el complemento autosómico y “X” representa el cromosoma X. Los cromosomas de origen materno se muestran en color rojo, los cromosomas de origen paterno en azul y los cromosomas L en verde. En las células germinales de la meiosis masculina se representan las dos cromátidas hermanas de cada cromosoma. Nótese que en el núcleo del espermatozoide, el origen materno de los cromosomas (rojo) es reconocido como paterno (azul) tras la fecundación. Modificada de Goday y Esteban (2001).

Hay dos clases de especies en Sciara: monogénicas y digénicas. Las especies monogénicas, como S. coprophila, poseen dos tipos de hembras, ginogénicas y androgénicas, que únicamente producen en su descendencia hembras o machos, respectivamente (Gerbi, 1986). El sexo está determinado por la madre cuyo carácter ginogénico o androgénico viene definido genéticamente (Moses and Metz, 1928). El carácter ginogénico o androgénico de una hembra reside en el cromosoma X: las hembras ginogénicas son X’X y las androgénicas XX (Figura 7). El cromosoma X’ posee una inversión que actúa como un “aislador” que previene la formación de cromosomas recombinantes viables con su cromosoma X homólogo (Metz, 1938; Gerbi, 1986). Las hembras ginogénicas producen oocitos predeterminados a eliminar un único cromosoma X y, por lo tanto, producen solamente hembras en su descendencia. Las hembras androgénicas producen oocitos predeterminados a eliminar dos cromosomas X y, por lo tanto, producen solamente machos en su descendencia (Figura 7). Así pues, los oocitos de hembras ginogénicas y los de hembras androgénicas difieren, exclusivamente, en la cantidad de factor materno que aportan al cigoto.






Hembra

Ginogénica



Macho

Hembra Androgénica

Soma

X´X

X0

XX

Línea germinal

X´X

X0

XX

Gametos

Oocitos

Esperma

Oocitos




X´m

Xm

XpXp

Xm

Cigotos

X´mXpXp

X´mXpXp




XmXpXp




Xp

Xp




XpXp

Soma

X´X

XX




X0




Hembra

Ginogénica



Hembra

Androgénica






Macho

Figura 7. Producción de machos y de hembras androgénicas y ginogénicas en S. coprophila. El origen de los cromosomas, materno o paterno, se representa con m y p respectivamente.

Las especies digénicas, como S. ocellaris, son aquellas cuyas hembras producen en su descendencia tanto hembras como machos. Aunque a nivel poblacional la razón sexual (machos versus hembras) es 0,5, dicha razón varía de una hembra a otra (Mori et al., 1979). Se ha observado que la razón sexual depende de la temperatura del cultivo, coincidiendo el período de sensibilidad a la temperatura con el momento de la oogénesis durante la pupa. Así, por ejemplo, a 18-20ºC, el 50% de la descendencia son hembras y el otro 50% son machos; mientras que a 28-29ºC, las hembras constituyen un 70% de la descendencia y los machos un 30%, no siendo dicha desviación causada por la muerte selectiva de los machos sino por la transformación de éstos en hembras; esto es, al incremento en la eliminación de uno en vez de dos cromosomas X en los embriones (Nigro et al., 2007). Esto indica que a alta temperatura, las hembras producen en su gran mayoría oocitos predeterminados a eliminar uno en vez de dos cromosomas X.



Objetivos

El trabajo se enmarca dentro del estudio de la evolución de los mecanismos de determinación sexual en insectos. Uno de los propósitos es buscar en otros insectos los genes homólogos de los que forman la cascada de determinación sexual en Drosophila, y comparar cuánto se ha modificado dicha cascada entre las especies más ancestrales de los insectos y el linaje evolutivo más reciente de los drosofilidos. En la presente tesis doctoral el objetivo ha sido el aislamiento y la caracterización del homólogo del gen doublesex de D. melanogaster en el díptero S. coprophila.



Materiales y Métodos



1 MATERIALES

1.1 Mantenimiento de S. coprophila y S. ocellaris

S. coprophila y S. ocellaris se crecieron a una temperatura de 18 ºC. Como fuente de alimento se añadió una capa abundante de micelio triturado del champiñón comercial (Compost Villacasa, Casasimarro, Cuenca).

1.2 Mantenimiento de D. melanogaster

D. melanogaster se creció a una temperatura de 25 ºC en botellas y tubos de cristal que contenían aproximadamente 20 ml y 50 ml, respectivamente, de medio de cultivo estándar compuesto por: 70 g/l de azúcar moreno, 50 g/l de harina de trigo, 100 g/l de levadura de panificación, 11.5 g/l de agar y 5 ml/l de ácido propiónico.

1.3 Productos

Se han utilizado productos procedentes de las casas comerciales que se enumeran a continuación: Amersham Biosciences, Amersham Pharmacia Biotech, Bio Rad, Biotecx, Clontech, Invitrogen, Kodak, Merck, Perkin Elmer, Promega, Pronadisa, Qbiogen, Quiagen, Roche, Santa Cruz Biothecnology y Sigma.



1.4 Medios de cultivo y Soluciones

La composición de los medios de cultivo y soluciones utilizadas (PBS, STE, SSPE, TBE, LB) se encuentran descritas en Maniatis et al., (1982).



2 MÉTODOS


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