Trabajo práctico n° 4 El operón lactosa



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Facultad de Ciencias Naturales

Sede Pto. Madryn

Cátedra de Biología Celular y Molecular


TRABAJO PRÁCTICO N° 4

El operón lactosa


Objetivo: Comprobar la inducción de la ß-galactosidasa en presencia de su inductor fisiológico, la lactosa.

Introducción Teórica:
En las células bacterianas, las cuales no presentan un núcleo organizado, las moléculas de RNA durante su formación son completamente accesibles a ribosomas y otros elementos del aparato de síntesis proteica, permitiendo la ocurrencia de este proceso mientras todavía se están formando las moléculas de mRNA.

Debido a que los dos procesos, de transcripción y transducción, pueden ocurrir juntos la iniciación de la transcripción se presenta como un punto crítico del control génico en procariotas cuya finalidad última consiste en permitir que el organismo se adapte a las variaciones de las concentraciones de nutrientes en su medio, de tal manera que el crecimiento y la multiplicación se vean optimizadas.

A diferencia de los procariotas y a pesar de que algunos genes en metazoos pueden responder a cambios ambientales, el control génico en eucariotas tiende a la regulación del desarrollo embriológico y de la diferenciación tisular.

En bacterias, un promotor actúa sobre uno o varios clusters de genes. Los clusters, conjunto de genes denominados operones, son transcriptos en una única molécula de mRNA y son traducidos independientemente. Estos mRNA policistrónicos codifican para más de una cadena polipeptídica (cistrón: menor unidad genética que codifica a un polipéptido).

Los genes de un determinado operón, el cual codifica para varias enzimas de una vía metabólica, están controlados coordinadamente transcribiéndose todos o ninguno, constituyendo de esta forma un sistema de control de la economía celular.

La composición de nutrientes en el medio en el cual se halla una bacteria, determina cuales promotores y por lo tanto cuales operones serán transcriptos a un tiempo determinado. De tal manera un operón que lleva la información para poner en marcha la vía enzimática necesaria para el metabolismo de un determinado nutriente, será transcripto solamente cuando dicho nutriente esté presente en el medio.

A esta respuesta específica se la ha denominado inducción enzimática, y a las enzimas sintetizadas en presencia o en ausencia de su sustrato específico, enzimas inducibles.

La inducción y represión de enzimas bacterianas ocurre especialemente mediante un control a nivel de la transcripción de genes específicos llamados genes reguladores. Estos genes codifican para un pequeño grupo de proteínas reguladoras, las cuales ayudan a la célula a adaptarse al ambiente, y de acuerdo a ello regulan positiva o negativamente la transcripción de los genes estructurales, mediante su unión directa al DNA.

Las proteínas reguladoras que ejercen un control negativo (represoras), se unen a las cercanías del sitio promotor llamado operador, el cual muchas veces se encuentra solapado con el primero, evitando físicamente el acceso de la RNA polimerasa al gen u operón en cuestión y la subsecuente transcripción de los mismos. Los represores pueden combinarse además con pequeñas moléculas llamadas efectores, las cuales modifican su afinidad de unión al operador aumentándola (correpresores), o disminuyéndola (inductores).

Otro tipo de proteínas reguladoras las cuales ejercen un control positivo (activadores), se unen al DNA en el promotor o en las cercanías del mismo, aumentando la frecuencia de unión de la RNA polimerasa.



Operón lactosa: Control negativo de la transcripción
El experimento más importante en regulación génica en bacterias se realizó sobre el metabolismo de la lactosa en Escherichia coli.

Si E. coli crece en un medio rico en lactosa (disacárido de glucosa y galactosa) u otro galactósido químicamente similar, las concentraciones de tres proteínas se verán aumentadas: -galactosidasa (rompe la molécula de lactosa en glucosa y galactosa); permeasa (proteína intrínseca de membrana que interviene en el transporte de lactosa hacia el interior celular) y transacetilasa (su rol todavía no ha sido dilucidado).

Los genes que codifican para estas tres proteínas constituyen la parte estructural del operón lactosa.

La lactosa o un producto metabólico de la misma induce la transcripción del operón. Los estudios genéticos y bioquímicos sobre el operón LAC fueron los primeros en definir el concepto de control negativo de la iniciación de la síntesis de mRNA.

La composición genética del operón lactosa de una bacteria normal se expresa mediante tres letras: Z+ Y+ A+, las cuales indican que las formas activas de las tres proteínas son producidas. Una mutación en uno de los genes produce una proteína alterada o completamente inactiva.

El hallazgo más importante fue el de mutante normal para las tres proteínas estructurales del operón, pero incapaz de realizar la regulación génica. Las mutantes reguladoras que producen las tres proteínas, incluso en ausencia del inductor, son llamadas constitutivas en contraste con las inducibles, las cuales sintetizan las proteínas únicamente en presencia de la lactosa.

Pruebas genéticas han demostrado que algunas de las mutaciones responsables de la síntesis constitutiva de las proteínas del operón, residen en el gen inducible I.

La naturaleza y función de este gen actuando como represor, fue propuesta por F. Jacob y J. Monod (1950). El tipo salvaje de bacteria inducible tiene el genotipo i+ z+ y+ a+, mientras que los mutan-tes constitutivos de la lactosa presentan el genotipo i- z+ y+ a+. El gen i+ determina la síntesis del represor que está ausente o es inactivo en i- . La proteína represora se une a un segmento de 25 a 35 pb del DNA, región que incluye varias bases antes y 20 bases después del sitio de iniciación para la síntesis del mRNA de la ß-galactosidasa. El sitio de unión de la RNA polimerasa también se encuentra en esta región, ya que el promotor solapa al operador. Este solapamiento explica porqué la unión del represor al operador interfiere con la síntesis del mRNA.

Recientemente se ha demostrado que la RNA polimerasa puede unirse al promotor, inclusive en presencia del represor, pero no puede iniciar la síntesis del mRNA indicando que el represor evita la inicialización de la transcripción más que la unión de la polimerasa.
Protocolo:
A) Curva patrón del O-Nitrofenol:
Se empleará el O-nitrofenol como parámetro para determinar la síntesis de la galactosidasa, inducida por la presencia de lactosa .

1) Preparar una solución de CO3Na2 0.5 M (PM=81), en un volumen de 10 ml.

2) Preparar la solución de O-Nitrofenol en CO3Na2 0.5 M 1 mg/ml, y realizar una serie de diluciones al medio. Preparar un blanco con CO3Na2 0.5M.

3) Leer a una longitud de ondas de 420 nm para el O-Nitrofenol.

4) Construir la curva patrón graficando D.O (nm) vs. concentración de O-Nitrofenol (mg/ml).
A) Inducción del operón lactosa
Materiales biológicos:
-Cultivo de E.coli Tw1 y Tw2
Materiales:
1) -Medio con D-glucosa: Triptosa 1 g

Glucosa 1 g

ClNa 0,5 g

agua dest. 100 ml

Emplear un volumen de 15 ml.
2) -Medio con lactosa: Triptosa 1 g

Lactosa 1 g

ClNa 0,5 g

agua dest. 100 ml

Emplear un volumen de 15 ml
3) -Medio sin Hidratos de carbono: Triptosa 1 g

ClNa 0,5 g

agua dest. 100 ml

Emplear un volumen de 15 ml.


Procedimiento:
1) Preparar los medios de cultivo.

2) Autoclavar.

3) Sembrar E. coli en cada medio e incubar 6 h, para permitir la inducción del operón lac.

4) Centrifugar 10' a máxima rpm. Descartar el sobrenadante y secar invertido sobre papel tissue.

5) Agregar a cada tubo: 10 µl de tolueno

5 µl de Cl2Mg 0,1 M

5 µl de -mercaptoetanol 1: 3 en agua dest.

6) Agitar.

7) Agregar a cada tubo 2 ml de O-Nitrofenol -galactósido (ONPG) en buffer fosfato 0,2 M pH 7,2 1mg/ml.

8) Centrifugar 5' a máxima rpm.

9) Incubar 30' a 37C.

10) Del medio con lactosa, ir tomando una alícuota de 2ml a los 5', 10', 20' y 30'. Colocarlos en sendos tubos y frenar la reacción enzimática con igual volumen de CO3Na2 1 M.

11) Leer a 450 nm.

12) Una vez obtenidas las D.O a los distintos tiempos, calcular los moles de O-Nitrofenol formados empleando la curva patrón, y con ellos determinar las unidades enzimáticas de la ß-galactosidasa.


Nota: Una unidad enzimática de la ß-galactosidasa se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 mmol de o-Nitrofenol por minuto en las condiciones de pH y temperatura indicadas.

(PM O-Nitrofenol=139).


Bibliografía:
1) Darnell, J.; Lodish, H. D. Baltimore. (1990) Molecular Cell Biology. 2da ed. Scientifican American Books. Inc. N.Y.

2) Stryer, L. (1984) Bioquímica. 2da ed. Ed. Reverte. Barcelona.

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