Seminario nº 2: espectrofotometría uv-vis



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ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VIS.
La absorción y emisión de energía radiante que realizan las moléculas y los átomos constituye el fundamento de muchos procedimientos en Química Analítica. Los datos obtenidos nos aportan información tanto cualitativa como cuantitativa. Cualitativamente, porque las posiciones de las líneas o bandas de emisión o absorción en el espectro electromagnético indican la presencia de una sustancia determinada. Cuantitativamente porque midiendo las intensidades de dichas líneas o bandas de emisión o de absorción puede determinarse la concentración.
RELACIONES CUANTITATIVAS DE LA ABSORCIÓN. LEY DE BEER.
Los principios que rigen la absorción de la radiación se aplican a todas las regiones del espectro electromagnético. La absorción se mide determinando la disminución de potencia experimentada por un haz de radiación como resultado de las interacciones con las especies absorbentes situadas en la trayectoria de dicho haz.
La Ley de Beer establece que a una  dada, en la que pueda ocurrir absorción, al aumentar la concentración de la disolución (c) de absorbente, disminuirá la cantidad de luz transmitida:


A = kbc

Donde k (otras veces “a” ) es la llamada absortividad o coeficiente de extinción. En el caso de emplear concentraciones molares (c, mol/L) la ley sería:

A = bc

Donde  es el coeficiente de extinción molar ó la absortividad molar.


La constante k, a, ó , es una medida relativa de la intensidad de absorción de un compuesto. Depende del disolvente, de la longitud de onda y de las condiciones experimentales (pH, Tª, etc.), pero es independiente de c y de b.
La relación entre la transmitancia (T) y la absorbancia (A) sería:
A = log 1/T %T = T. 100 T = %T/100
A = log 1/%T/100 = 2 – log %T
Un espectro de absorción es una representación gráfica que relaciona las características de absorción del analito con la  utilizada en su análisis. En el eje de ordenadas se representa generalmente A, logA, T ó %T, mientras que en el eje de abscisas se representan unidades de .
Las curvas a, b, c y d de la siguiente figura representan concentraciones cada vez mayores de una determinada muestra. La A, aumentará evidentemente al aumentar la c (ó b), mientras que el %T disminuye.

En la figura se muestra también un ejemplo de una gráfica de la ley de Beer: al representar A frente a las concentraciones a, b, c y d se encuentra una función lineal, tal que predice la ley de beer. La pendiente de la recta será  sí b = 1cm.


La ley de Beer se cumple igualmente para disoluciones que contienen más de una especie absorbente, siempre que no se produzca interacción entre dichas especies. Por tanto para un sistema multicomponente se cumplirá:

Atotal = A1 + A2 + ......... + An


Atotal = a1bc1 + a2bc2 + .......... + anbcn
Los subíndices se refieren a las especies absorbentes.


Limitaciones a la ley de Beer.
La relación lineal entre A y b para c = cte. ocurre generalmente en todos los casos. Sin embargo, se observan frecuentemente desviaciones de la proporcionalidad directa entre A y c para b=cte. Algunas de estas desviaciones son importantes y representan limitaciones reales de la ley. Otras desviaciones ocurren como consecuencia de la forma en que se realizan las medidas de absorbancia ( desviaciones instrumentales), ó bien como consecuencia de cambios químicos asociados con cambios de concentración (desviaciones químicas).


Reales



Limitaciones
Químicas

Aparentes*

Instrumentales
*Se llaman desviaciones o limitaciones aparentes porque reflejan dificultades experimentales mas que alguna insuficiencia de la Ley de Beer por sí misma.
Limitaciones reales de la ley de Beer.
La ley de Beer es solamente aplicable a disoluciones en las cuales las interacciones, dependientes de la concentración, entre moléculas o iones absorbentes sean mínimas. Estas interacciones, que generalmente comienzan a aparecer a concentraciones superiores a 0’01M, alteran las absortividades molares, , y, por tanto, conducen a una relación no lineal entre A y c.



A =cte a cualquier c< 0’01M A cte c>0’01M

tg=b

c<0’01M



c c

También surgen desviaciones reales debido a que la  de una sustancia depende del índice de refracción de la disolución, que a su vez es dependiente de la concentración de analito, cuando las concentraciones son mayores de 0’01M.


Desviaciones químicas.
Se producen desviaciones aparentes de la Ley de Beer cuando las especies absorbentes experimentan disociación, asociación o reacción con el disolvente, originando productos con características absorbentes distintas de las del analito. Estos efectos que producen una alteración del equilibrio químico pueden ser debidos al pH, presencia de complejantes, reacciones laterales, etc.
Desviaciones instrumentales.
La ley de Beer es una ley límite en el sentido de que una linealidad verdadera entre absorbancia y concentración requiere la utilización de radiación monocromática (una sola  ). En la práctica, se producen desviaciones significativas cuando se mide en una banda de absorción que no se corresponde con el máximo de absorbancia en el espectro (ver figura). En estas circunstancias se originan grandes cambios de absorbancia en función de  y la  deja de ser constante produciéndose una curva en vez de una recta al representar A en función de c.

fig.


También pueden darse desviaciones instrumentales debido a los efectos de fatiga de los detectores, falta de linealidad de los amplificadores de señal, inestabilidad de las fuentes de energía radiante etc. Sin embargo, con los instrumentos modernos para espectrofotometría estos problemas se han resuelto en gran parte.
Advertencia: Por muy moderno que sea un espectrofotómetro debemos de verificar el equipo instrumental antes de suponer que se cumple la Ley de Beer para un sistema químico determinado.
INSTRUMENTACIÓN.
Los instrumentos que miden la absorbancia o la transmitancia de una disolución se componen de cinco elementos básicos:


  1. Fuente estable de energía radiante.

  2. Selector de longitudes de onda (para aislar una determinada región de longitudes de onda de la fuente)

  3. Cubetas transparentes para la muestra.

  4. Detector de radiaciones o transductor para convertir la energía radiante en eléctrica.

  5. Dispositivo de lectura.

fig


La naturaleza y complejidad de un equipo de absorción depende de la región de  implicada y de cual va a ser el uso principal del instrumento, sí para medidas cualitativas o bien cuantitativas. Sin embargo la función de cada componente es siempre la misma.
La primera etapa que debe realizarse siempre antes de cualquier medida de absorbancia es el ajuste del medidor de señal. En primer lugar se ajusta el cero de transmitancia bloqueando la radiación antes del detector con un obturador o introduciendo una cubeta opaca (ajuste del 0 % de T). A continuación se ajusta el indicador al 100% de T (o cero de absorbancia), este ajuste se realiza con el disolvente o blanco en la trayectoria del haz incidente. Para ello, se varía la intensidad de la fuente o bien se altera la amplificación de señal del detector. Finalmente, la absorbancia o el %T se puede obtener directamente sustituyendo el disolvente por la disolución que contiene en analito.
Fotómetros y espectrofotómetros.
Los componentes descritos anteriormente se pueden combinar de distintas maneras para fabricar docenas de instrumentos para realizar medidas de absorción. El diseño de estos equipos varía desde los más sencillos a los más sofisticados, existiendo notables diferencias en su precio. La selección de un instrumento se debe hacer según el tipo de trabajo para el que va a ser destinado.
Fotómetros: Un fotómetro es un instrumento sencillo y relativamente barato para el análisis de absorción. Poseen generalmente una alta resistencia y es fácil de mantener. Se utiliza principalmente cuando el análisis no requiere una alta pureza espectral.

fig.


En la figura se muestra un diagrama esquemático de un fotómetro de un solo haz y lectura directa. El equipo utiliza una lámpara de filamento de volframio, lentes para proporcionar un haz paralelo de radiación, un obturador, un filtro, un atenuador de haz en forma de cuña y un detector. El atenuador se mueve hacia dentro o hacia fuera del haz para variar su intensidad cuando se hace el ajuste del 100%T.
Una causa importante de inestabilidad en la medida son las fluctuaciones en la intensidad de fuente (error instrumental). Por esta razón, la mayoría de los equipos de haz simple requieren algún tipo de estabilizador de corriente.
Los instrumentos de un solo haz son particularmente adecuados para medidas cuantitativas de absorción a una única longitud de onda (medidas puntuales). Las cubetas que contienen la cubeta y el blanco se sitúan alternativamente en la trayectoria del haz.
Los fotómetros se suministran con diversos filtros, cada uno de los cuales transmite en una zona del espectro. La selección del filtro adecuado determina en gran parte la sensibilidad de las medidas de absorbancia. Por ejemplo, una disolución de color rojo absorbe radiación verde. (La intensidad de la radiación verde absorbida será función de la concentración) por tanto debemos seleccionar un filtro verde (o sea que emita verde que es el que absorbe el rojo ¡olé!).
En general, el filtro mas adecuado para un método fotométrico será el del color complementario a la disolución a analizar.
Espectrofotómetros: Los espectrofotómetros están equipados con un monocromador de prisma o red, que permite la selección de cualquier longitud de onda dentro de la capacidad del instrumento. Un diagrama esquemático de un espectrofotómetro de haz simple sería igual al del fotómetro de filtro de la figura anterior siendo la diferencia principal la sustitución del filtro por el monocromador.
La siguiente figura representa un espectrofotómetro de doble haz:
fig.

La luz procedente del monocromador se divide mecánicamente con un interruptor giratorio ("chopper"), que dirige alternativamente el haz a través de la muestra y del blanco. El detector por tanto recibe una señal intermitente que se convierte en una señal eléctrica que es fácilmente amplificada. Se ha de hacer todo lo necesario para asegurar que la trayectoria recorrida por la luz a través de las dos cubetas sea idéntica. Dado que esta comparación se realiza simultáneamente o casi simultáneamente, un aparato de doble haz compensa la mayoría de las fluctuaciones transitorias así como el funcionamiento irregular de la fuente, detector y transductor.


APLICACIONES ANALÍTICAS.

El proceso de absorción. Análisis Cualitativo UV-VIS.

Como todos los seres humanos sabemos, los átomos, iones y moléculas tienen un número limitado de niveles discretos de energía cuantizada. Para que se produzca la absorción, la energía del fotón debe coincidir exactamente con la diferencia de energía existente entre el estado fundamental de la especie absorbente y uno de sus niveles energéticos excitados. Estas diferencias de energía son únicas para cada especie y originan espectros característicos que se utilizan frecuentemente para la identificación cualitativa y la determinación cuantitativa tanto de sustancias orgánicas como inorgánicas.


La absorción por moléculas poliatómicas es un proceso complejo ya que el número de los posibles estados excitados de energía es muy elevado. La energía total de una molécula viene dada por:


E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

Eelectrónica = Energía asociada a los electrones de los orbitales externos de la molécula
Evibracional = Energía de la molécula, considerada como un todo, debida a las vibraciones interatómicas
Erotacional = Energía asociada a la rotación de la molécula alrededor de su centro de gravedad

La Electrónica es generalmente mayor que las otra dos, y las energías necesarias para producir transiciones de los electrones externos de una molécula corresponden a radiaciones en las regiones UV y VISIBLE.


Existen numerosos estados de energía vibracional y rotacional para cada estado electrónico. Por tanto, para un determinado valor de Eelectrónica, existirán valores de E que serán solo ligeramente diferentes debido a variaciones de la Evibracional y/o rotacional. Por ello, el espectro de absorción UV o VISIBLE de una molécula estará formado por bandas de absorción, como se muestra en la figura para el vapor de benceno.

Absorción por compuestos orgánicos.
La absorción de radiación por moléculas orgánicas en la región de  de 180 a 750nm se origina por la interacción de los fotones y aquellos electrones que o bien participan directamente en el enlace y están, por tanto, asociados a más de un átomo, o bien están localizados sobre átomos tales como O, S, N, X.
La  a la que absorbe una molécula orgánica depende de la fuerza con la que estén unidos sus distintos electrones. Así, los electrones compartidos con enlaces sencillos C–C o C–H (enlaces) están unidos tan firmemente, que la absorción ocurre solo en la región del UV–vacio <180nm donde también absorben los componentes del aire (esta absorción se utiliza raras veces con fines analíticos).
Los electrones implicados en dobles o triples enlaces de moléculas orgánicas no están tan fuertemente retenidos, y son, por tanto, más fácilmente excitados por la radiación. Así pues las especies con enlaces múltiples (dobles o triples) generalmente presentan unos máximos de absorción útiles. Los grupos funcionales orgánicos insaturados que absorben en las regiones UV ó VIS se denominan cromóforos. En la siguiente Tabla se muestran los cromóforos más comunes y las  aproximadas a las que absorben.

TABLA.


Los datos de posición e intensidad del máximo deben servir únicamente como guía orientativa con fines de identificación, ya que ambos están influenciados por los efectos del disolvente así como por otros detalles estructurales de la molécula. Además la conjugación entre dos o más cromóforos tiende a provocar desplazamientos de los máximos de los picos a  mayores (hacia el VIS).

Los electrones no compartidos en elementos como S, Br, I, etc., están retenidos menos fuertemente que el par de electrones de un enlace saturado. Como consecuencia de ello, las moléculas orgánicas que contienen esos elementos presentan con frecuencia picos de absorción útiles en la región UV.



Absorción por especies inorgánicas.
En general los iones y complejos de las dos primeras series de transición absorben radiación VIS al menos en uno de sus estados de oxidación y son, en consecuencia, coloreados. Aquí, la absorción supone transiciones entre “orbitales d” ocupados y libres. Las diferencias de energía entre estos orbitales d (y, por tanto, la posición del correspondiente pico de absorción) dependen de la posición del elemento en el sistema periódico, su estado de oxidación y la naturaleza del ligando al que está unido.
La absorción por transferencia de carga es de gran importancia desde el punto de vista analítico, ya que las  de los máximos de transferencia de carga se encuentran entre las mayores observadas en espectroscopia (>10.000). Estas  proporcionan por tanto sensibilidades altas. Muchos complejos presentan este tipo de absorción y se conocen como complejos de transferencia de carga. Estos complejos, contienen generalmente un grupo dador de electrones, y uno aceptor dentro del complejo. La absorción de radiación implica la transición de un electrón desde el grupo dador al aceptor. El estado excitado es, por tanto, el resultado de un proceso de oxidación-reducción interno.
Ejemplos comunes son los complejos de tiocianato, el complejo de Fe(II) con o-fenantrolina y el complejo de ferrocianuro férrico responsable del color azul Prusia.
Análisis cuantitativo UV-VIS.
La espectroscopía de absorción en las regiones UV-VIS es una de las herramientas más ampliamente utilizadas para el análisis cuantitativo. Entre las características más importantes del método figuran las siguientes:


  1. Gran campo de aplicación: Numerosas especies inorgánicas y orgánicas absorben en la región UV-VIS, y son, por tanto, susceptibles de ser determinadas cuantitativamente. Además muchas especies no absorbentes, mediante un tratamiento químico adecuado se las puede transformar en absorbentes.




  1. Elevada sensibilidad: Las altas  comprendidas entre 5.000 y 40.000, particularmente en complejos de transferencia de carga, permiten límites de detección en el intervalo 10-4 a 10-5M.




  1. Selectividad entre moderada y alta: El paso previo de separación se hace innecesario si se logra encontrar una región de longitudes de onda en la que el analito sea la única especie absorbente en la muestra.




  1. Buena exactitud: El error relativo en una medida espectrofotométrica típica es del orden del 1 al 3%.




  1. Facilidad y comodidad: Las medidas espectrofotométricas con los modernos equipos son rápidas y cómodas. Además los métodos se prestan frecuentemente a la automatización.



Aplicación a especies absorbentes.
En la Tabla anterior aparecen muchos grupos cromóforos comunes. Es, por tanto, la determinación espectrofotométrica factible para compuestos orgánicos que contienen uno o más de estos grupos.
También hay algunas especies inorgánicas que absorben como el ó el . Muchos iones de metales de transición tienen color en disolución y por tanto se pueden determinar por medidas espectrofotométricas.
Aplicación a especies no absorbentes.

Muchos analitos no absorbentes se pueden determinar haciéndolos reaccionar con reactivos cromóforos, originando compuestos que absorben intensamente en las regiones UV-VIS. La aplicación adecuada de estos reactivos formadores de color requiere generalmente que su reacción con el analito sea completa.



Método analítico.
El primer paso de cualquier análisis fotométrico o espectrofotométrico es el establecimiento de las condiciones que den como resultado una relación, a ser posible lineal entre la absorbancia y la concentración del analito.


  1. Selección de la longitud de onda: Para obtener una sensibilidad máxima, las medidas espectrofotométricas se realizan a una  correspondiente a un pico de absorción, porque, como ya pusimos de manifiesto, la variación de la absorbancia por unidad de concentración es máxima en este punto.




  1. Optimización de variables que influyen en la absorbancia: Entre las variables más comunes se encuentran la naturaleza del disolvente, el pH, fuerza iónica y la presencia de sustancias interferentes. Los efectos de estas variables se deben estudiar y se deben elegir aquellas condiciones del análisis que permitan que la absorbancia no se vea prácticamente afectada




  1. Determinación entre la A y la concentración: Los datos de A pueden manejarse de diferentes modos en análisis cuantitativo. La escala va desde 0 a  pero la máxima exactitud se obtiene en el intervalo de 0’1 a 1’0 por lo tanto las condiciones experimentales se deben elegir de manera que la absorbancia producida ocurra dentro de dicho intervalo: las disoluciones que originen A demasiado elevadas se diluyen y las de A baja se concentran. Normalmente esto se prevé mediante una determinación preliminar.


A1 = 1b1c1 A1/A2 = 1b1c1/2b2c2


A2 = 2b2c2 1 = 2 b1 = b2

A1 / A2 = c1/c2


Los patrones de calibración para un análisis fotométrico o espectrofotométrico deben de ser tan semejantes como sea posible a la composición de las muestras y deben abarcar un intervalo razonable de concentraciones del analito. En raras ocasiones, o casi nunca, se puede suponer que se cumple la ley de Beer y utilizar un patrón único para determinar la absortividad molar. Aún menos prudente es basar los resultados de un análisis en un valor de absortividad molar obtenido en la bibliografía.




  • Método de adición de patrón.



Podemos encontrarnos con grandes dificultades, incluso insuperables, para preparar patrones con una composición similar a la muestra a analizar. En estas circunstancias, el “Método de la adición de patrón” puede resultar muy útil.

En este método se mide la absorbancia de dos disoluciones:




  • Disolución A: Contiene una concentración desconocida de analito c1

  • Disolución B: Contiene lo mismo que A más un volumen conocido de patrón de concentración c2

Se comparan a continuación las absorbancias de ambas disoluciones las cuales vendrán dadas por:


Adisolución A = bc1
Adisolución B = b (v1c1+v2c2)/v1+v2 = b (v1c1+v2c2)/vT
v1 = Volumen de la disolución A en la disolución B
v2 = Volumen de patrón de concentración c2
Dividiendo m.a.m. tendré:
AA /AB = c1/(v1c1+v2c2)/vT c1 = AAv2c2/vTAB-v1AA



  • Análisis de mezclas.

Como ya se dijo anteriormente la absorbancia total de una disolución a cualquier longitud de onda es igual a la suma de las absorbancias de los componentes individuales de la disolución. Esta relación en principio hace posible determinar las concentraciones de los componentes individuales de una muestra incluso si existe solapamiento total de sus espectros correspondientes. Por ejemplo, la siguiente figura muestra el espectro de una disolución que contiene una mezcla de especies A y B así como los espectros de absorción de los componentes individuales (obviamente no existe una  a la que la absorbancia se deba solamente a uno de los componentes A o B). Para analizar la mezcla se determinan primero las absortividades molares de A y B a las longitudes de onda 1 y 2 (con los patrones necesarios para asegurar que se cumple la ley de Beer en un intervalo de absorbancias en el que esté incluido la absorbancia de la muestra). Nótese que las  seleccionadas para el análisis son aquellas en las que los dos espectros difieren significativamente. Las ecuaciones que se dan pueden escribirse del siguiente modo:


Si b = 1cm y como

cA1 = cA2 = cA



cB1 = cB2 = cB

A1 = A1cA + B1cB



A2 = A2cA + B2cB
FIG.





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