Química Biológica



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Química Biológica 2010

Química Biológica

TP 7 ELECTROFORESIS ,

Introducción
La electroforesis es una técnica que permite separar sustancias cargadas por influencia de un campo eléctrico externo, es una técnica muy difundida para la separación de proteínas y ácidos nucleicos. Se basa: en las diferentes velocidades de migración que experimentan en un campo eléctrico las distintas partículas cargadas eléctricamente o bien en el tamaño de la partícula que se desplaza.

La velocidad de migración depende principalmente de la densidad de carga y de la intensidad del campo eléctrico aplicado. La electroforesis puede realizarse sobre tiras de papel de acetato de celulosa o bien sobre geles de agarosa o de arcrilamida-poliacrilamida.


La electroforesis en acetato de celulosa se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. Durante la corrida en acetato las moléculas se moveran según su densidad de carga. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas (cometas) y se logra una separación en bandas bien definidas. Además de la buena resolución este método tiene otras ventajas: la separación es muy rápida, se pueden emplear pequeñas cantidades de muestras, pueden recuperarse y aislar los componentes de la muestra.


El estimulo eléctrico se realiza a través de un solución buffer cuyo pH es escogido según la mezcla que se quiere separar. Debido a la naturaleza anfolítica de las proteínas, la carga eléctrica se modifica con el pH del medio, definiéndose entonces como punto isoeléctrico (pI), al pH en el cual la molécula no tiene carga eléctrica neta y entonces no migrará en un campo eléctrico. Si el pH se encuentra por debajo del pI, predominan las cargas positivas y a la inversa a un pH superior al pI.
La electroforesis en geles es una técnica de separación de proteínas y puede aplicarse también en ácidos nucleicos. En ambos casos la separación ocurre a través de un gel cuyo tamaño de poro es regulado según ciertas características propias de cada corrida. Si lo que se va a separar son proteínas y fragmentos pequeños de ácidos nucleicos se utiliza un gel preparado con acrilamida y bisacrilamida, mientras que para fragmentos grandes de ADN y ARN se emplean geles de agarosa.
En la electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), la mezcla de proteínas es mezclada con un detergente aniónico (SDS) y en ocasiones un agente reductor que desnaturaliza la proteína (se rompe los enlaces disulfuro), para formar complejos desnaturalizados (polipéptidos desplegados) y cargados negativamente. También se agrega un colorante que permite observar el frente de la corrida. La relación carga / masa es similar en todas las proteínas de la mezcla. Aquí como la densidad de carga es uniforme las proteínas se separaran por su tamaño, las de menor pesor molecular atravesaran más rápido los poros del gel.



La electroforesis SDS-PAGE es un sistema de corrida discontinuo formado por dos geles con tamaño de poro distinto, en un primer gel (de siembra o compactador) de poro mayor y menor pH, y un segundo gel donde ocurre la separación. Luego de transcurrida la corrida se deben revelar los geles empleando distintas sustancias, radiación o luz uv.



Parte experimental
Electroforesis en tiras de cellogel
Objetivo:

  • Separar mediante electroforesis las proteínas contenidas en el suero sanguíneo.

La muestra biológica que se utiliza es suero sanguíneo humano, los pI de las proteínas del suero van desde 4,9 (albúmina) hasta 7,4 (gama globulinas) por lo que se utiliza una solución tampón Veronal sódico (dietilbarbiturato de sodio 40 mM pH 8,5 )


En suero humano la composición normal es

Albúmina ........... 54-62%

α globulinas ....... 9-15%

β globulinas ....... 8-13%

γ globulinas ....... 14-19%

Soporte: tiras de acetato de celulosa



  1. Acondicionamiento de la tira:

Las tiras de cellogel se conservan en metanol al 40%, por esto es necesario lavarlas primero con abundante agua y luego somergirlas en la cuba con el buffer de electroforesis Veronal sódico por 10 minutos. Escurrir el exceso de buffer y colocar la tira sobre el soporte de la cuba, con la superficie opaca hacia arriba, debiendo quedar bien fija y plana.




  1. Siembra:

Mezclar la muestra biológica con el colorante (azul de bromofenol) sobre una placa de vidrio. Sembrar la muestra en la zona catodo y aplicar 2 mA por siembra. Observar el frente de la corrida.




  1. Revelado:

Una vez finalizada la corrida, que dura aproximadamente 40 minutos, se sumerge la tira 5 minutos en el colorante, que puede se Amidoschwartz (0,5% en metanol, agua, ácido acético 4,5 : 4,5 : 1) o Ponceau S (rojo Ponceau 0,5% en ácido tricloroacético, agua 5:95). Las tiras luego se decoloran en solución decolorante (metanol, agua, ácido acético 47,5 : 47,5 : 5), de tal manera que finalmente sólo retienen el color las bandas de proteínas.



Observar la tira, graficar y reconocer las bandas proteicas

Electroforesis en geles de poliacrilamida PAGE



Objetivo:

  • Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con proteínas patrones, en un gráfico de distancia vs. Log PM aparente


Actividades:
Determinación del peso molecular
Se hizo correr una mezcla de proteínas junto con una mezcla de proteínas control de peso molecular (PM) conocido. La movilidad de la proteina se conoce como Rf, el cual se obtiene de la siguiente manera:
Rf = distancia recorrida por la proteína / distancia recorrida por el colorante
Teniendo en cuenta que la movilidad de la proteína es inversamente proporcional al logaritmo del PM, Realiza un grafico log PM VS Rf de la mezcla patrón y luego estima los PM de las proteínas contenidas en la muestra



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