Parcial Módulo II, Enzimas



Descargar 16.91 Kb.
Fecha de conversión26.04.2018
Tamaño16.91 Kb.

Parcial Módulo II, Enzimas. 20 de Octubre de 2004.

Problema 1.

En un laboratorio se cuenta con dos enzimas provenientes de dos microorganismos distintos. Las enzimas, denominadas A y B, catalizan la misma reacción química y tienen los siguientes parámetros cinéticos y/o condiciones de ensayo:






Enzima A

Enzima B

Km (mM)

1000

10

Vmax (mmol/min)

1000

100

El protocolo experimental que usa este laboratorio exige trabajar a tres concentraciones distintas de sustrato: 10, 100 y 1000 mM.



  1. Para cada una de estas concentraciones de sustrato encuentre cuál es la enzima más rápida.

  2. En el mismo laboratorio, dos frascos que contienen a las enzimas A y B perdieron sus etiquetas. Explique un protocolo que le permita asignar sin lugar a dudas el tipo de enzima que contiene cada frasco.

  3. Se quiere modificar genéticamente la secuencia que codifica para la enzima B para mejorar sus propiedades cinéticas. Se desea trabajar con esta enzima modificada a una concentración de 10mM de sustrato. Algunos bioquímicos del laboratorio manejan la hipótesis de disminuir 10 veces la Km de la enzima. Otros dicen que se tendría un mejor efecto si se aumentara 10 veces la Vmax. Podría decir cuál hipótesis daría una enzima con mayor velocidad en las condiciones del ensayo?


Problema 2.
La enzima fumarasa cataliza la siguiente reacción:
L-Malate Fumarate + H2O
Se ha estudiado la actividad de la enzima en función del pH. El gráfico de abajo muestra dicho comportamiento.





  1. En base al gráfico, explique el comportamiento de la Vmax de la enzima en función del pH.

  2. Puede sacar alguna conclusión sobre los aminoácidos involucrados en la catálisis? En tal caso cuál/es aminoácidos serían? Justifique.

  3. El malato es un ácido orgánico cuya carga neta varía también con el pH. Qué ensayos haría para descartar el efecto de la ionización del sustrato sobre la actividad de la enzima?


Problema 3.

Cuando se estudia la cinética de una determinada enzima se encuentra que ésta tiene un comportamiento sigmoidal cuando se grafica la velocidad inicial en función de la concentración de sustrato(figura 1).



V0



V0



Figura 1




[S]

[X]

En un segundo ensayo se usa la misma concentración de enzima y la concentración de sustrato marcada con una flecha (figura 1). Usando esta mezcla de reacción, se estudio el efecto de una sustancia X sobre la actividad de la enzima. Los resultados se muestran en la figura 2.







  1. Qué tipo de enzima se utiliza en este ensayo?

  2. A que se debe el efecto de la sustancia X sobre la cinética de la enzima?


Problema 4.

Ud. está encargado de poner a punto un nuevo práctico de Bioquímica I. Este práctico consistirá en estudiar la cinética de la enzima invertasa (Km = 2.5 mM), enzima que cataliza la siguiente reacción:


Sacarosa D-glucosa + D-fructosa
El avance de la reacción se puede seguir determinando la presencia de azúcares reductores (D-glucosa y D-fructosa) para lo cual cuenta con los reactivos necesarios para la reacción del dinitrosalicílico (DNS). Esta reacción produce un intenso color en presencia de azucares reductores, color que se puede medir a 540 nm. El coeficiente de absortividad molar para este complejo coloreado es de 60000 1/M cm. Además cuenta con las siguientes soluciones:
Stock de Enzima = 30 UI/ml

Stock de sustrato = 250 mM


La mezcla de reacción (10 ml) tiene la siguiente composición:
1ml de solución de sustrato

500 microlitros de enzima

8,5 mililitros de solución de buffer
Para ensayar la reacción del DNS y seguir la cinética de la reacción, a distintos tiempos se extraen 500 microlitros de la mezcla de reacción y se lo recoge en 1 ml de solución que contiene el DNS y el buffer necesario para la reacción. A esta ultima mezcla (1.5 ml) se le mide la absorbancia a 540nm.


  1. Siguiendo el protocolo indicado más arriba, podría explicar como prepararía la mezcla de reacción para que la enzima trabaje a una concentración de sustrato saturante?

  2. Sería deseable que los alumnos pudieran determinar una velocidad inicial en aproximadamente 30 minutos. Podría calcular la cantidad de enzima en la mezcla de reacción tal que en esos 30 minutos se pueda medir una velocidad inicial estadísticamente significativa? Para esto considere que la máxima absorbancia medible con escaso error es 0.8.


Problema 5.

Para cada uno de los siguientes casos esquematice el comportamiento cinético utilizando gráficos. Justifique el comportamiento observado utilizando ecuaciones.




  1. Variación de actividad enzimática en función de la concentración de enzima

  2. Variación de la actividad enzimática en función de la concentración de sustrato

  3. Variación de la actividad enzimática en función del tiempo.

  4. Igual que el punto c pero con un inhibidor irreversible.


Compartir con tus amigos:


La base de datos está protegida por derechos de autor ©composi.info 2017
enviar mensaje

    Página principal