Objetivo conocer las características elementales de las tinciones más empleadas, así como el montaje de la muestra



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Manual de Prácticas de Histología




1.2 Técnicas de tinción utilizadas en Histología

OBJETIVO




Conocer las características elementales de las tinciones más empleadas, así como el montaje de la muestra.

INTRODUCCIÓN




En ciertos casos, cuando es preciso destacar alguna estructura celular o tisular, se pueden emplear ciertas sustancias colorantes inocuas para la vida de las células y que tampoco modifican la estructura ni interfieren con sus funciones. A este procedimiento se le conoce como coloración vital.

La coloración vital puede ser de dos tipos:


Coloración intravital. Consiste con la administración de colorantes vitales a través de las vías digestiva e intratraqueal, sanguínea, linfática, subcutánea o intraperitoneal para demostrar actividad fagocítica de ciertas células (macrófagos del pulmón o del tejido subcutáneo, células de Küpffer o las dendríticas fagocíticas de los órganos linfáticos) o calcular la cantidad de determinados organelos celulares como las mitocondrias. Las soluciones de uso más común son la tinta china, carmín de litio y azul de tripán (partículas que demuestran la capacidad fagocítica).
Coloración supravital. Se emplean colorantes que se aplican a células o porciones tisulares extraídas de organismos vivos. Este tipo de coloración demuestra de manera específica componentes celulares como mitocondrias con el verde de Jano, los gránulos de las células cebadas con el rojo neutro, la sustancia granulofilamentosa de los reticulocitos con el azul brillante de cresilo, las ramificaciones nerviosas con el azul de metilo o el DNA y RNA de las células con naranja de acridina (mediante el microscopio de fluorescencia).

Coloración o tinción

Los cortes de los tejidos adheridos a los portaobjetos están listos para colorearse, una vez realizado el procedimiento de la práctica 1. El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante. Se considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al lavarse con el líquido que disuelve el colorante no se decolora. Es una sustancia colorante la que puede transferir su color a otro cuerpo. Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración:


Teoría física. Presupone que la coloración es un proceso físico de adsorción. De acuerdo con esto, las partículas de las sustancias colorantes disueltas penetran en los espacios intercelulares e intracelulares en los que se mantienen adheridas en razón de la cohesión molecular. Por ejemplo, la coloración de las grasas o lípidos es una tinción puramente física, pues el Sudán III o el Sudán IV se absorben por la facilidad que tienen para disolverse es estas sustancias.
Teoría química. El colorante se une a la sustancia coloreable íntimamente debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en los componentes celulares o tisulares, que se unen a los cromógenos básicos o ácidos de los colorantes, respectivamente. Así se forman sales insolubles. De acuerdo con esta teoría, los colorantes se unen (ligan) a los tejidos por enlaces iónicos, covalentes o de hidrógeno.
El enlace iónico o electrostático ocurre cuando el colorante y la sustancia a teñir desarrollan diferentes cargas eléctricas y entonces se atraen la una a la otra; por ejemplo, el citoplasma se colorea porque las proteínas citoplasmáticas poseen carga eléctrica (+) y las partículas del colorante tienen carga eléctrica (-).
Existen varios criterios para clasificar los colorantes: Por su origen, pueden ser naturales y artificiales (sintéticos). Los colorantes naturales proceden de:


  1. Animales, como el carmín, que se extrae de la cochinilla.

  2. Vegetales., como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo de Campeche”.

En cambio, los colorantes artificiales o sintéticos son productos derivados de la destilación de la hulla o carbón. Genéricamente se conocen como colorantes derivados de la anilina. Los colorantes artificiales y sintéticos se clasifican en:




  1. Ácidos. Son sales cuya parte básica en incolora y el componente ácido posee color. Así, en el colorante eosina o eosinato de sodio la propiedad colorante se debe al ácido eosínico y no a la base, el sodio. Los colorantes ácidos tienen carga eléctrica negativa, por lo tanto la designación correcta sería la de colorantes aniónicos. Las sustancias que atraen eléctricamente a los colorantes ácidos se denominan acidófilas y químicamente están constituidas por componentes básicos o alcalinos. Son ejemplos de ellas la eosina, amarillo de metanilo, fucsina ácida, ácido pícrico, verde rápido, naranja G, safranina, azul de anilina, y otros.

  2. Básicos. Son sales que poseen la base coloreada y la porción ácida incolora. Por ejemplo, el azul de metileno, o clorhidrato de azul de metileno debe su propiedad colorante a la base azul de metileno y no al ácido clorhídrico, que es incoloro. Poseen una carga eléctrica positiva y por lo tanto son colorantes catiónicos. Se les conoce también como colorantes nucleares porque tienen afinidad por los ácidos nucleicos (DNA y RNA). Las sustancias teñidas por los colorantes básicos se denominan “basófilas” y están constituidas por componentes ácidos. Son ejemplos de ellas la hematoxilina, rojo nuclear, azul de metileno, tionina, azul de toluidina, fucsina básica, entre otros.

  3. Neutros. Son sales en las que tanto la parte básica como la ácida proporcionan color; por ejemplo el eosinato de azul de metileno. Estos colorantes tienen la propiedad de teñir de una manera simultánea los componentes nucleares y los citoplasmáticos e incluso pueden emitir colores distintos a determinados componentes citoplasmáticos, como las granulaciones específicas de los granulocitos (cierto tipo de glóbulos blancos o leucocitos). Forman parte de las fórmulas colorantes para frotis de sangre, como los colorantes de Wright, May Grunwald, Giemsa, Leischman, y otros.

  4. Indiferentes. No forman sales. Son compuestos no iónicos incapaces de producir la disociación electrolítica. Son insolubles en agua, pero solubles en solventes orgánicos como el alcohol y también en las grasas o lípidos y, aunque poseen color, en realidad, es sentido estricto, no son colorantes. Sobre la base de su solubilidad en las grasas, estas sustancias se emplean para demostrar la presencia de grasas en células y tejidos, pues tiñen selectivamente los lípidos. Son ejemplos de ellas el Sudán negro, Sudán III, Sudán IV y rojo oleoso.

Existe una serie de procedimientos por intermedio de los cuales células y tejidos se tiñen por lo colorantes. De acuerdo con ellos, las coloraciones se clasifican en:




  1. Coloración directa o sustantiva: se denomina así a la tinción que se ejerce sobre células y tejidos cuando éstos se ponen en contacto con la solución colorante. El resultado indica una verdadera afinidad entre tejido y colorante. Ejemplo: la tinción de los núcleos por el azul de metileno.

  2. Coloración indirecta o adjetiva: para que se lleve a efecto la coloración es indispensable recurrir al empleo de sustancias intermediarias que faciliten la adherencia del colorante a las estructuras tisulares. La sustancia intermediaria utilizada se denomina “laca”. La mayoría de las soluciones colorantes de hematoxilina requiere un mordiente para que el colorante tenga efecto.

  3. Coloración progresiva: se refiere a la marcha misma de la coloración y consiste en que los tejidos se ponen en contacto con la solución colorante para que, conforme transcurre el tiempo de coloración, el tejido, de manera progresiva, alcance la intensidad de tinción deseada. En dicho momento se detiene la coloración mediante lavado y eliminación del colorante sobrante.

  4. Coloración regresiva: en este caso los tejidos se sobrecolorean con la solución de coloración para someterlos después a la acción de una sustancia denominada diferenciador, cuya función consiste en extraer parte de l colorante. Mediante la observación al microscopio, el proceso de diferenciación se detiene cuando los componentes celulares o tisulares a colorear alcanzan la tinción deseada.

  5. Coloración simple: se denomina así al procedimiento de coloración en el que se utiliza un solo colorante para teñir algún componente celular o tisular. Por ejemplo, teñir los núcleos con tionina.

  6. Coloración compuesta o combinada: es la aplicación de varios colorantes a una muestra de tejido u órgano con objeto de destacar mediante colores diferentes estructuras específicas que forman parte de ella. Según esta clasificación, la coloración puede ser a su vez: Simultánea: cuando en una misma solución de coloración se mezclan varios colorantes. En este caso los tejidos reciben la tinción en el mismo momento. Ejemplos: las soluciones colorantes de algunos tricrómicos como el de van Gieson (fucsina ácida y ácido pícrico) el de Mallory (azul de anilina y naranja G) o el de Shor (verde brillante, fucsina ácida y naranja G).

Sucesiva: esta coloración consiste en aplicar a los tejidos soluciones sucesivas de varios colorantes con la finalidad de que ciertos componentes se tiñan con algunos de ellos. El ejemplo más ilustrativo es la coloración de hematoxilina y eosina (HyE), en la que los núcleos se tiñen primero con la hematoxilina y después la eosina se encarga de colorear el citoplasma.

  1. Coloración ortocromática: se conoce así a la acción de coloración que ejerce un colorante al teñir una determinada estructura con su propio color. La gran mayoría de los colorantes produce coloración ortocromática.

  2. Coloración metacromática: es una reacción de coloración en la que un colorante, además de proporcionar su propio color a una estructura celular o tisular, también tiñe de distinto color otras estructuras. La tionina y el azul de toluidina colorean de azul los núcleos y otras estructuras basófilas, pero, al mismo tiempo, ciertos componentes tisulares como la mucina, la matriz cartilaginosa o el ácido hialurónico se colorean de violeta o rosado.

  3. Coloración pancromática: se produce por la actividad de tinción de los colorantes neutros. En este caso, tanto la porción básica como la ácida de estos colorantes ejerce su acción de tintura, pero además ciertos componentes celulares se tiñen de colores diferentes a los originales y adquieren tonalidades que resultan de la mezcla de ellos. El ejemplo más claro de esta acción de coloración se produce cuando se tiñen frotis de sangre. El empleo de las soluciones colorantes de Wright, May Grunwald, Giemsa o Leischman da lugar a que las plaquetas y los leucocitos (granulocitos y mononucleares) muestran granulaciones específicas e inespecíficas fácilmente diferenciables por esta capacidad pancromática del colorante.


Montaje. Concluido el proceso de tinción de los cortes, éstos de deben colocar en condiciones de protección para poderlos utilizar muchas veces sin que se deterioren. Para alcanzar tales propósitos se recurre al último procedimiento, que es el montaje.

Este procedimiento supone la colocación encima del corte coloreado y diáfano de una gota de una sustancia adherente, diluida casi siempre en xilol (resina natural como el bálsamo de Canadá o resinas sintéticas cuyos índices de refracción son similares a los del vidrio) y sobre ellos una laminilla cubreobjetos, con cuidado de no dejar burbujas de aire dentro de la resina. A continuación se deja que el xilol se evapore y la resina adquiera solidez suficiente para ello; las láminas se colocan en una platina caliente (45 a 50º) durante 24 a 48 horas, tiempo suficiente para que estén listas y puedan observarse.


RESPUESTAS A LAS PREGUNTAS DE CORRELACIÓN

  1. Clasificación de los colorantes de acuerdo a sus propiedades químicas


  1. Describa brevemente las diferencias de coloración supravital e intravital


  1. Enumere las semejanzas y diferencias entre los distintos tipos de tinciones


OBSERVACIONES






CUESTIONARIO

  1. ¿Por qué la tinción hematoxilina-eosina permite distinguir los núcleos del citoplasma?



  1. Describir la tinción de PAS y ¿en que situaciones se utiliza?



  1. ¿La tinción histológica es auxiliar del diagnostico? Justifique su respuesta


DISCUSIÓN

CONCLUSIÓN


REFERENCIAS CONSULTADAS

BIBLIOGRAFÍA
[1] José de Jesús Abad Moreno y colaboradores, La práctica Histológica, Segunda Edición, 155 pp, Ed Mc Graw Hill, México, 2002.


Dra. en C. Olga Yadira Barbosa Cisneros

Dra. en C.Ma. Guadalupe Solis Recendez



Q.F.B. Juan Armando Flores de la Torre

M. en C. Elena Donaji Ramírez Alvarado


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