Microscopía



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Recopilación Bibliográfica

Dra. María Guadalupe Klich



UNIDAD 2 – BIOLOGÍA - VETERINARIA

MÉTODOS DE ESTUDIO DE LAS CÉLULAS

Los diversos elementos que existen en la naturaleza presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.





Unidades de Masa y Longitud utilizadas en Biología Celular y Molecular

Puesto que las células son pequeñas para poder hablar de sus diferencias son necesarias unas unidades específicas.



  • UNIDADES DE LONGITUD:

µm (micra o micrómetro) = 10 -3 mm (milésima parte del milímetro)

nm (nanómetro) = 10 -6 mm

Ä (Ängstrom) = 10 -7 mm


  • UNIDADES DE PESO:

mg (miligramo) = 10 -3 g

µg (microgramo) = 10 -6 g

ng (nanogramo) = 10 -9 g

pg (picogramo) = 10 -12 g

d (dalton) = peso de un átomo de hidrógeno Ej: H2O =18 d

Kd (kilodalton)! 10 3 d. Ej: Hemoglobina= 64,5 Kd



Métodos de Observación de las Células

El microscopio (de micro-, μικρο, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. El tipo más común y el primero que se inventó es el microscopio óptico. Se trata de un instrumento óptico que contiene una o varias lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refracción.

El microscopio fue inventado hacia los años 1610, por Galileo, según los italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los componentes de la Accademia dei Lincei, una sociedad científica a la que pertenecía Galileo que publicó un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo, las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopía aparecen en 1660 y 1665, cuando Marcello Malpighi prueba la teoría de William Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia.

En 1665 Hooke observó con un microscopio un delgado corte de corcho y notó que el material era poroso. y con poros, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de cajas a las que llamó células. Se trataba de la primera observación de células muertas. Unos años más tarde, Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.

A mediados del siglo XVII un holandés, Anton Van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia, describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparación científica, puede considerarse el fundador de la bacteriología. Tallaba él mismo sus lupas sobre pequeñas esferas de cristal, cuyos diámetros no alcanzaban el milímetro (su campo de visión era muy limitado, de décimas de milímetro). Con estas pequeñas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observó los glóbulos de la sangre, las bacterias y los protozoos; examinó por primera vez los glóbulos rojos y descubrió que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida no reveló sus métodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres.

Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de vidrios pulidos cóncavos y convexos obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos, se lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes.

Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras ópticas. Las mejoras más importantes de la óptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbe publicó su teoría del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos mayores. A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a 500X o 1000X. Sin embargo, existía un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares (núcleo, mitocondria, etc.).

Microscopía Optica

El ojo humano es capaz de detectar variaciones en la longitud de onda y en la intensidad de la luz. La microscopía permitió aumentar ambas posibilidades, tanto mediante el uso de instrumentos que amplían el poder de resolución como de técnicas que contrarrestan la transparencia de las células aumentando el contraste de sus estructuras.

La mayoría de los componentes celulares son transparentes, a excepción de algunos pigmentos citoplasmáticos que absorben ciertas longitudes de onda de la luz. La baja absorción de esas longitudes por la célula viva se debe al alto contenido de agua. Un método para contrarrestar esta limitación consiste en emplear colorantes que tiñan selectivamente estos componentes celulares introduciendo diferentes compuestos que absorben longitudes de onda especificas. Sin embargo, las técnicas de coloración generalmente no se pueden usar en células vivas.



El Microscopio Óptico 


Microscopio óptico. Descripción: A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto, D) lentes de la iluminación, E) sujeción del objeto, F) espejo de la iluminación.
Un microscopio óptico es un microscopio basado en lentes ópticas. También se le conoce como microscopio de luz, microscopio fotónico (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una única lente pequeña y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espécimen). Este uso de una única lente convexa se conoce como microscopio simple en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos ópticos.

Aplicaciones del microscopio óptico


Este instrumento ha sido de gran utilidad, sobre todo en los campos de la ciencia en donde la estructura y la organización microscópica es importante, incorporándose con éxito a investigaciones dentro del área de la química (en el estudio de cristales), la física (en la investigación de las propiedades físicas de los materiales), la geología (en el análisis de la composición mineralógica de algunas rocas) y, por supuesto, en el campo de la biología (en el estudio de estructuras microscópicas de la materia viva), por citar algunas disciplinas de la ciencia.

Hasta ahora se sigue usando en el laboratorio de histología y anatomía patológica, donde la microscopía permite determinadas aplicaciones diagnósticas, entre ellas el diagnóstico de certeza del cáncer, numerosas estructuras cristalinas, pigmentos, lípidos, proteínas, depósitos óseos, etcétera.



Microscopio estereoscópico

El diseño de este instrumento es distinto al del diagrama de más arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscópica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visión binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ángulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscópicos, por definición, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos términos.



Corte de una hoja observado con Microscopio Óptico - 1.bp.blogspot.com/.../s1600/hoja+partida.jpg



Poder de Resolución del Microscopio Óptico

Como en cualquier otro microscopio, en el microscopio óptico el poder de resolución, que es la capacidad del instrumento de brindar imágenes distintas de puntos muy cercanos, depende de la longitud de onda y de la apertura numérica del objetivo (relacionada con el índice de refracción del medio).



Límite de resolución: distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales

Para el microscopio óptico varia entre 170 nm y 250 nm dependiendo de si la luz es monocromática o blanca.

El aumento de la imagen en el microscopio óptico depende principalmente de las lentes del objetivo, con las cuales el aumento máximo es de 100 X a 120 X. Como el ocular agranda la imagen del objetivo entre 5 y 15 veces, se llega a un aumento de 500 X a 1500 X

Aumento total: aumento objetivo x aumento ocular.
Microscopio electrónico.

Un microscopio electrónico es aquél que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imágenes de objetos diminutos. Los microscopios electrónicos permiten alcanzar una capacidad de aumento muy superior a los microscopios convencionales. El primer microscopio electrónico fue diseñado por Ernst Ruska, Max Knoll y Jhener entre 1925 y 1930, quiénes se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones.



Un microscopio electrónico, funciona con un haz de electrones generados por un cañón electrónico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnéticas (todo ello al alto vacío ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificación se produce por un conjunto de lentes magnéticas que forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscopios electrónicos sólo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromático

Microscopio electrónico de transmisión (MET)


El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de Angstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un millón de veces. Los electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección  del especimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen  sobre una pantalla fluorescente.

 




Poros en la membrane nuclear - cmap.udg.co.cu:8001/rid=1G90C008R-29MY5B5-H1T.

Microscopio electrónico de barrido. (MEB) 


Permite obtener imágenes topográficas tridimensionales de los objetos en estudio. En el microscopio electrónico de barrido la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un cañón. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectadas en una imagen de TV. Su resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie.



Polen - upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb




Estructura

Disposición de los elementos que componen un organismo y que pueden llegar a verse con un microscopio óptico

Ultraestructura
disposición de los elementos más pequeños que forman un organismo. Partículas y estructuras más allá del poder de resolución del microscopio óptico y que solo son visibles con el ultramicroscopio o microscopio electrónico

Microscopio de contraste de fases

El microscopio de contraste de fases permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas. Se recurre a cambios de fase (retrasos) en las radiaciones que atraviesan las estructuras biológicas. Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del especimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.

El microscopio de contraste de fases convierte las diferencias de índice de refracción en diferencias de claros/oscuros, que se hacen visibles al ojo humano.

Microscopio de NOMARSKI o Microscopio de Interferencia

Una variante del microscopio de contraste de fases es el Microscopio de NOMARSKI o microscopio de Interferencia en el que el rayo de luz blanca, después de atravesar las dos lentes, se divide en dos rayos polarizados que siguen trayectorias distintas y que se interfieren entre sí. La imagen resultante aparece en relieve. Este microscopio es útil para el estudio “in vivo” de células. Permite determinar cambios en el índice de refracción, mientras que el microcopio de fase solo revela las discontinuidades mas notables.

Aquí tenemos un ejemplo, varios paramecios conjugándose,

Vistos con contraste positivo (a la derecha) y en contraste negativo (a la derecha)

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Microscopio de luz ultravioleta

La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina. El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada célula.

El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda más cortas de la luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos microscopios están hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Además, dado que la radiación ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia, en fotografía o con un escáner electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigación científica.

Microscopio de Fluorescencia


El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.

El fenómeno de la fluorescencia se produce cuando un electrón de un átomo absorbe toda la energía de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situación inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energía que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital.

Aprovechando este fenómeno, se han creado los fluorocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitación que seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo.

Microscopio Confocal

El microscopio confocal es un microscopio que emplea una técnica óptica de imagen para incrementar el contraste y/o reconstruir imágenes tridimensionales. Esta técnica ha ido adquiriendo cada vez mayor popularidad entre las comunidades científica e industrial. Se aplica típicamente en las ciencias de la vida y en la inspección de semiconductores. El concepto de imagen confocal fue patentado por Marvin Minsky en 1957.

En el caso del microscopio confocal de rayos láser la fuente de iluminación es, como dice su nombre, la luz de un láser.  Esta luz potente y monocromática (o sea, de un sólo color) excita en la muestra lo que se llama fluorescencia.  Es decir, cuando un espécimen sea iluminado con luz de cierto color, éste emitirá luz brillante de otros colores.  El contraste es siempre impresionante pues sólo la muestra fluorescerá y el fondo permanecerá completamente oscuro.   Pero lo más extraordinario de este microscopio es que cualquier parte de la muestra que esté fuera de foco, será invisible.  Por lo tanto, el enfoque en toda foto obtenida por microscopía confocal de rayos láser será perfecto.

Más aún, aunque en microscopía confocal de rayos láser cada imagen representa un sólo plano de un espécimen que, en realidad, es tridimensional, si se retratan de forma sucesiva los distintos planos que integran la muestra, el microscopio puede hacer una reconstrucción completa del espécimen que lo muestre en sus tres dimensiones.  Esta reconstrucción tridimensional podrá incluso ser rotada para estudiar la muestra desde un ángulo distinto a aquel desde el cual se retrató.



microscopico.wordpress.com/confocal/

Métodos de Preparación de Células y Tejidos

En la mayoría de los organismos las células forman tejidos y órganos (pluricelulares) y no pueden observarse directamente, sino que deben sufrir un tratamiento hasta poder observarlos al microscopio



Proceso De Fijación.

Durante este proceso se inmoviliza a las células matándolas pero preservándolas y la sustancia utilizada es el fijador.

En términos químicos la fijación consiste en establecer puentes entre las diferentes macromoléculas que constituyen la célula, de forma que quedan situadas fijas en su posición original.

Por otra parte el fijador prepara a las células para la tinción (hace permeable las células a los colorantes).

Hay que realizar rebanadas finas para poder observar los tejidos y órganos al microscopio. Se utilizan los micrótomos. Existen diversos tipos, pero el más corriente es el micrótomo de rotación.

En el brazo que sube y baja tenemos el tejido que queremos cortar, y para ello hay una manivela.

Cada vuelta de la manivela, el brazo se mueve un número determinado de µm. Abajo hay una cuchilla que puede ser de acero, vidrio e incluso de diamante y el material depende del grosor de la sección que queramos obtener. Cada vez que el brazo baja se corta una sección que se dispone en el portaobjetos.

El grosor de las secciones para microscopía óptica es de 1-10 µm. Para microscopía electrónica las secciones tienen un grosor siempre por debajo de 0,1 µm.

Los tejidos y órganos son estructuras muy frágiles y no pueden cortarse directamente con el micrótomo (son blandos). Antes hay que realizar el proceso de inclusión.

La inclusión consiste en sumergir los tejidos y órganos en una sustancia que se denomina medio de inclusión que cuando está en forma líquida penetra en el interior de un tejido. Ese medio de inclusión se puede volver sólido y al volverse sólido se obtiene un bloque duro y rígido que se puede cortar en el microtomo.

Existen dos tipos principales de medios de inclusión:


  • Las parafinas que a una temperatura mayor a 55-60ºc son líquidas, y a Tª ambiente son sólidas.

  • Las resinas sintéticas, que a Tª ambiente son líquidas y a más de 70ºC se lleva a cabo un proceso de polimeriazación irreversible de forma que el bloque es imposible que vuelva a disolverse.

Hay un método alternativo a la inclusión. La pieza puede volverse dura mediante la congelación, que normalmente se realiza en nitrógeno líquido que está a temperatura baja o a nieve carbónica, , Tº de -70ºC.

El seccionamiento de la pieza congelada se lleva a cabo en un micrótomo con una cámara fría de -20ºC que recibe el nombre de micrótomo criostático o criostato.

Cuando observamos una sección con el microscopio de campo claro no vemos prácticamente nada, pues las células suelen ser invisibles y hay que llevar a cabo el proceso de tinción, para el que se utilizan una serie de colorantes orgánicos. Cada colorante se une a un componente específico de la célula.

Cultivo de Células y Tejidos

El cultivo celular es el proceso mediante el que células, ya sean células procariotas o eucariotas pueden cultivarse en condiciones controladas. En la práctica el término "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de células aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animales. El desarrollo histórico y metodológico del cultivo celular está íntimamente ligado a los del cultivo de tejidos y el cultivo de órganos.

El cultivo de células animales empezó a ser una técnica rutinaria de laboratorio durante los años 50, pero el concepto de mantener líneas de células vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX. El cultivo masivo de líneas celulares animales es fundamental para la manufactura de vacunas virales y diversos productos biotecnológicos. Los productos biológicos producidos mediante la tecnología del ADN recombinante en cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintéticas, inmunobiológicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancerígenos). A pesar de que muchas proteínas pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos bacterianos, las proteínas más complejas que son glicosiladas (modificadas mediante el agregado de carbohidratos) deben producirse en células animales. Un ejemplo relevante de tales proteínas complejas es la hormona eritropoyetina. Actualmente, se están realizando investigaciones para producir tales proteínas complejas en células de insectos o de plantas superiores, debido al alto costo que implica producir tales proteínas complejas en células de mamíferos.

El cultivo de tejidos vegetales es una técnica basada en colocar un fragmento de planta en un recipiente ayudado con soluciones nutritivas artificiales y hormonas vegetales; para propagarla en condiciones o en un medio estéril, es decir en un medio libre de microorganismos (limpio). Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se tomó el fragmento, aunque puede ser modificada genéticamente para tener variedades artificiales.


Suspensiones celulares


En las últimas décadas se ha desarrollado diferentes sistemas para los cultivos de protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye una forma para mantener y propagar células vegetales.

Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes si tienen un suministro continuo de nutrimentos.


Citometría de flujo


La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Las células sanguíneas pueden analizarse prácticamente de manera directa, las células de tejidos sólidos deben primero dispersarse. Las células pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar a alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000 células por segundo).

Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados.

La tecnología tiene aplicaciones en un número de campos, incluyendo la biología molecular, la patología, la inmunología, la biología vegetal y la biología marina.

Es especialmente útil en el campo de la biología molecular cuando se usan anticuerpos etiquetados fluorescentemente. Estos anticuerpos específicos se unen a antígenos de las células y ayudan a dar información de las características específicas de dichas células estudiadas. Tiene grandes aplicaciones en medicina (especialmente en trasplantes, hematología, inmunología de tumores y quimioterapia, genética y selección de esperma en IVF).

En la biología marina, las propiedades autofluorescentes del plancton fotosintético pueden ser explotadas por citometría de flujo para caracterizar la abundancia y estructura de las comunidades marinas..

Citoquímica e Histoquímica

Consiste en la identificación in situ de los diferentes compuestos químicos de las células o tejidos. Es cuali y cuantitativa.

Para la determinación citoquímica de una sustancia deben cumplirse los siguientes requisitos: 1- debe ser inmovilizada en su posición original. 2- deber ser identificada por un procedimiento que sea específico para ella o para un grupo químico que contenga. Esto se logra por medio de métodos físicos o por reacciones químicas similares a las usadas en química analítica, pero adaptadas a los tejidos.

Fraccionamiento Subcelular

El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, ..) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical,...), complejos multiproteicos (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros nucleares, etc..), etc...

Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas :


  • rotura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación.

  • separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugación diferencial), la presencia de algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.)

Técnicas de rotura de células y tejidos

El primer paso en la purificación de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.

Los procedimientos de homogenización más comunes son :


  • sonicación. Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. Dependiendo de la frecuencia, intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.

  • uso de detergentes que solubilicen las membranas celulares.

  • pasar las células a través de orificios de diámetros reducidos que provocan la rotura de las membranas celulares.

  • homogenizadores. Se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador. Existen dispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared de cristal para producir homogenizados con un tamaño de partícula determinado.



Centrifugación

Una vez obtenido el lisado o homogenado celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad mayor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones : sobrenadante ('supernatant'), fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento ('pellet') que ha quedado adherida al fondo del tubo.

Centrífuga

Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densida mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en : centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 xg), super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 xg a 20000 xg) y ultracentrífugas (de 15000 xg a 600000xg). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea neceario hacer un intenso vacio en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.

Centrifugación diferencia La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes,.. y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.
Análisis Molecular del ADN

Este tema se explicará en las Unidades 6 y 7 cuando se posean conocimientos sobre la estructura del ADN.




Normas generales de uso del laboratorio



Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad.

  1. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan.

  2. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado.

  3. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material.

  4. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.

  5. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor.

  6. No tacar con las manos y menos con la boca los productos químicos.

  7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.

  8. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.

  9. Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared.

  10. Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: ácido sobre agua.

  11. Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco.

  12. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el Centro.

  13. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo superior para regular la caída de líquido.

  14. Al enrasar un líquido con una determinada división de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal.

  15. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen líquidos debe evitarse la ebullición violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercará a la llama inclinado y procurando que ésta actúe sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullición rápida, se retirará, acercándolo nuevamente a los pocos segundos y retirándolo otra vez al producirse una nueva ebullición, realizando así un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitará dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona.

  16. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos calentado con el fin de evitar roturas.

  17. Los cubreobjetos y portaobjetos deben tomarse por los bordes para evitar que se engrasen.


Trabajo Práctico Unidad 2


El Microscopio óptico compuesto



     PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO



  • Sistema mecánico

    • SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

    • PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.

    • CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, …..

    • REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.

    • TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto.

  • Sistema óptico

    • OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo.

    • OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta.

    • CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

    • DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

    • FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

 SISTEMA MECÁNICO

Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque del preparado.



Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.

Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico.

Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque.



Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm.

Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles de interés.

Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.

SISTEMA ÓPTICO

Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de iluminación; el primero consta de:

Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio).

  

Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.



El sistema óptico de iluminación consta de:

Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador.

  

Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm. del espejo.



CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS:

 ESCALA DE REPRODUCCIÓN: relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc.

 PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos.

 LÍMITE DE RESOLUCIÓN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado.

 PODER DE RESOLUCIÓN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución.

 PODER DE PENETRACIÓN: es la propiedad de permitir la observación simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento.

 DISTANCIA FRONTAL: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo.



 AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

  1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones.

  2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

  3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.

  4. Para realizar el enfoque:

    1. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos.

    2. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

  1. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión.

  2. Empleo del objetivo de inmersión:

    1. Bajar totalmente la platina.

    2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.

    3. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40.

    4. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.

    5. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.

    6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.

    7. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande.

    8. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.

    9. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.

    10. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.

     MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES

  1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.

  2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.

  3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.

  4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio.

  5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción.

  6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador).

  7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular.

  8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol.

  9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos.

Recursos Didácticos para Biología. José A. Cortés .com




Gemación de levaduras



MATERIAL

  • Microscopio

  • Portaobjetos

  • Cubreobjetos

  • Levadura

  • Agua azucarada

  • Aguja enmangada

  • Lactofenol-safranina

     TÉCNICA



  1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada.

  2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio.

  3. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad:

    • Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina.

    • Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras.

    RESULTADOS. Dibujar




Observación microscópica de hongos



OBJETIVOS

  1. Realizar preparaciones en fresco de distintas especies de mohos.

  2. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan

MATERIAL

  • Microscopio

  • Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol

  • Aguja enmangada o lanceta

  • Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos

  • Solución de lactofenol al azul algodón





PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS

 

     TÉCNICA



  1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra.

  2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos.

  3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el definitivo

  4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado.

  5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios.

  

  RESULTADOS



  • Moho del tomate:   

  • Aspergillus

  • Penicillum:  



Observación de pulpa de tomate



MATERIAL

  • Microscopio

  • Portaobjetos

  • Cubreobjetos

  • Escalpelo

  • Pinzas

  • Tomate


     TÉCNICA

  1. Utilizando un escalpelo, corta en dos mitades el tomate.

  2. Obtén, ayudándote de unas pinzas, un trozo de pulpa de tomate de unos 2mm de grosor.

  3. Deposítalo en el centro de un portaobjetos sin poner agua.

  4. Coloca encima un cubreobjetos y comprime suavemente con los dedos hasta obtener un completo aplastamiento del fragmento de pulpa de tomate.

  5. Lleva la preparación a la platina del microscopio y realiza una observación con pequeños aumentos. Selecciona el mejor grupo de células y pasa a mayores aumentos.

  6. Identifica los distintos orgánulos celulares visibles y dibuja lo que observes en el apartado observaciones.

     RESULTADOS

El resultado de esta práctica debe ser semejante a lo que muestran las siguientes fotos obtenidas con microscopio óptico:



  • Células de la pulpa del tomate x150

  • Cromoplasto de célula de tomate x600



Observación de epidermis de cebolla



MATERIAL

  • Microscopio

  • Portaobjetos

  • Cubreobjetos

  • Cubeta

  • Agujas enmangadas


     TÉCNICA

  1. Separar una de las hojas interna de la cebolla y desprender la tenue membrana que está adherida por su cara inferior cóncava.

  2. Depositar el fragmento de membrana en un porta con unas gotas de agua. Pon el porta sobre la cubeta de tinción para que caiga en ella el agua y los colorantes. Si es preciso, estirar el trozo de epidermis con ayuda de dos agujas enmangadas.

  3. Escurrir el agua, añadir una gotas de verde de metilo acético (o azul de metileno) sobre la membrana y dejar actuar durante 5 minutos aproximadamente. ¡No debe secarse la epidermis por falta de colorante o por evaporación del mismo!

  4. Con el cuentagotas bañar la epidermis con agua abundante hasta que no suelte colorante.

  5. Colocar sobre la preparación un cubreobjetos evitando que se formen burbujas y llevarla al microscopio.

  6. Observa la preparación a distintos aumentos, empezando por el más bajo. Identifica las distintas células del tejido epidérmico y las de las hojas del bulbo de cebolla.

     RESULTADOS

  • Aspecto general de la epidermis 

    • Epidermis de cebolla en fresco x150

    • Epidermis de cebolla azul de metileno x150



BIOLOGIA – UNIDAD 2


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