Los fungicidas triazoles



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CAPÍTULO 2


  1. LOS FUNGICIDAS TRIAZOLES.

Como se mencionó en el capítulo anterior, el control de la enfermedad de la Sigatoka Negra actualmente se fundamenta en el control químico y el monitoreo continuo de las plantaciones. Dentro del control químico, los fungicidas Triazoles, Morfolinas y Estrobirulinas son los que han demostrado mayor efectividad en el control de la enfermedad; no obstante, los fungicidas Triazoles han sido los más utilizados para controlar la enfermedad en nuestro medio, después del descarte de los Benzimidazoles.


La mayor demanda por este tipo de fungicidas en nuestro país la tienen los sectores bananeros y florícolas, mientras que, a nivel internacional su uso se reparte en muchos más cultivos. En 2001, el consumo de estos fungicidas en nuestro país representó cerca del 10% del consumo nacional de fungicidas, lo que equivale a 140Tm, nivel en el que ha permanecido relativamente estable desde 1998 (26).


    1. Generalidades.

Los fungicidas Triazoles pertenecen a la Clase I de los fungicidas Inhibidores de la Biosíntesis del Esterol (Sterol Biosynthesis Inhibitors, SBI’s), al grupo de los Inhibidores de la Demetilación del Carbono 14 (DMI’s) (Código FRAC: 3) (13). Es uno de los grupos fungicidas más ampliamente utilizados en todo el mundo para en control de enfermedades en numerosos cultivos; así como también, en el tratamiento de enfermedades fungosas en animales y humanos (22).
Los fungicidas Triazoles deben su nombre al anillo aromático que poseen en su estructura molecular, el cual representa el sitio activo del fungicida (Figura 2.1) (22,27). Además del anillo Triazol, estos fungicidas presentan otros grupos funcionales que potencian la actividad del Triazol (e.g. Fenil), y en algunos casos tienen efectos reguladores en el crecimiento de los vegetales (e.g. hidroxilos) (25,27).

FIGURA 2.1

ESTRUCTURA QUÍMICA DEL FENBUCONAZOL*

*En rojo se muestra el anillo Triazol


También es importante notar, que las características estereoquímicas de estos compuestos pueden incrementar su efecto, debido a la forma en la que estos fungicidas interactúan con el sitio de acción en el hongo (27).


    1. Mecanismo de Acción: Interacción con el metabolismo de los esteroles.

Los Triazoles ejercen su acción fungicida al inhibir la actividad de la enzima esterol NADPH:oxígeno oxidoreductasa (EC. 1.14.13.70; esterol-14-demetilasa), perteneciente al Complejo Citocromo P-450 (CYP) (21,22,25,27). Esta enzima es la encargada de catalizar la demetilación del C14 durante la transformación del Lanosterol en Ergosterol (Anexo 1) (27,33); como consecuencia, se produce la acumulación de 14-metil-esteroles en lugar de esterol en la membrana celular del hongo, perjudicando la viabilidad fisiológica de la misma (21,22,27).
De forma general, las enzimas citocromo P-450 son enzimas tipo heme-tiolato, donde el grupo prostético es siempre un átomo de hierro unido a residuos azufrados de Cisteína (Cis) (Figura 2.2) (31).
FIGURA 2.2

CITOCROMO P-450



A. Grupo Heme-Tiolato de las enzimas Citocromo P-450.

B. Enzima esterol-14-demetilasa.

Modificadas. Werk-Reichhart & Feyereisen. Cytochromes P-450: A Success Story. 2000. / http://www.brenda.uni-koeln.de


Las reacciones tradicionales de esta familia de enzimas son las reacciones de oxidación en las se que utiliza una molécula de oxígeno como agente oxidante, además de un sistema adecuado de cofactores (usualmente NAD, NADP, FAD, FMN y sus formas reducidas) que actúan como donadores y aceptores de electrones (14,31).
En la naturaleza la cantidad de reacciones catalizadas por este tipo de enzimas es realmente amplia, llegando a reportarse su actividad sobre más de mil sustratos distintos (14), sus funciones principales son la detoxificación de sustancias xenobióticas, la catálisis de reacciones del metabolismo endógeno (principalmente esteroides, sales biliares, vitaminas liposolubles y alcaloides) y en algunos organismos es parte de mecanismos de defensa contra patógenos y alcaloides tóxicos de las plantas (14,19,31).
Los fungicidas Triazoles alcanzan su máximo de acumulación dentro del micelio del hongo después de 15 o 20 minutos luego de entrar en contacto con el microorganismo (22). Los triazoles se unen al sitio de acción de la enzima en dos lugares: al átomo de Hierro del grupo Heme, a través del anillo Triazol; y al sitio de unión de la enzima con el sustrato, a través de los otros sustituyentes (27).
Al sitio activo de la enzima se accede por medio de un largo canal en su molécula. En la superficie de la enzima adyacente a la entrada del canal, existe un grupo de aminoácidos hidrófobos cuya función es reconocer al Lanosterol (27). Los Triazoles también pueden ser reconocidos por estos aminoácidos, y luego de ingresar al canal, los electrones  delocalizados del anillo triazol son atraídos por los orbitales de coordinación del Hierro del grupo heme, para finalmente enlazarse a este covalentemente a través del átomo N4 (31). Por otra parte, el grupo fenilo (usualmente en C2 o C3) se sitúa en la cavidad hidrófoba de la enzima (Figura 2.3) (27).
Adicionalmente, la presencia de grupos metil u oxígeno en la posición C2 o C3 (los carbonos adyacentes al anillo triazol) tienden a favorecer la actividad antifúngica, mientras que, cualquier radical en posición 2 o 6 dentro del anillo bencénico tiende a reducir la afinidad con la enzima y por tanto la actividad fungicida (27).

FIGURA 2.3

INTERACCIÓN ENTRE LA MOLÉCULA DEL TRIAZOL Y LA ENZIMA ESTEROL-14-DEMETILASA. (CYP).

Tomada de: Sádaba et al. Relación entre Estructura y Función de los Azoles. 2004


La conformación espacial de la molécula del fungicida es también un factor que puede incrementar o reducir la actividad de la molécula; esto se debe a que, generalmente, el C2 o C3 son carbonos quirales; pudiendo de esta manera, un mismo compuesto, presentar dos o más estereoisómeros que difieren en la forma en la que se acoplan a la molécula de la enzima y consecuentemente exhiben distintos niveles de actividad sobre los hongos (27).

Al inhibirse la acción de la esterol-14-demetilasa durante la biosíntesis del Esterol, se producen esteroles no demetilados (14-metil-esteroles) al final de esta ruta metabólica en lugar de esterol (21,22,27). Los 14-metil-esteroles reemplazan al esterol en su ubicación en la membrana del hongo (27). Estos compuestos, rompen las uniones entre los fosfolípidos de la membrana y de esta forma modifican la permeabilidad y estabilidad de la misma (22,27); adicionalmente, modifican la actividad de otras enzimas presentes en la membrana de los hongos y, por estas causas, el hongo detiene su crecimiento, y al no poderse alimentar finalmente muere (21,22,27).





    1. Desarrollo de Resistencia y Tolerancia a los Fungicidas Triazoles: Mecanismos de Resistencia.

Los mecanismos mediante los cuales los hongos han logrado expresar resistencia a los fungicidas Triazoles aún no están satisfactoriamente identificados (4,5). Numerosos estudios, desarrollados en los distintos campos de aplicación de este tipo de fungicidas, han revelado más de un mecanismo de resistencia; estos mecanismos exhiben una gran variabilidad según la especie del hongo y la molécula fungicida utilizada en el estudio (30).
De forma general hasta 1982, después de cerca de 10 años de uso comercial en agricultura, existían muy pocos reportes de resistencia a los fungicidas DMI’s. El mayor número de estas cepas resistentes se habían originado en laboratorios a través de tratamientos mutagénicos; estas cepas, a pesar de haber expresado resistencia a los DMI’s habían perdido patogenicidad y viabilidad, por lo que, se consideró que la expresión de mecanismos de resistencia a esto fungicidas era muy poco probable (4).
No obstante, durante la década de 1980 se manifestaron mecanismos de resistencia efectiva en varios patógenos, aunque de forma lenta y muy variable en severidad (4). El problema más claro de resistencia a estos fungicidas se manifestó en el control del Mildew Polvoriento de la cebada, del pepino y de la vid. Posteriormente, este problema también se manifestó de forma notable en la Sigatoka Negra del banano1 y la Roña de la Manzana (4).
Como ya se mencionó, varios mecanismos han sido reportados como responsables de la expresión de resistencia en distintas especies de hongos (4,30). No obstante, se puede anotar que son tres los principales fenómenos asociados a la manifestación de este problema:


  1. Reducción de la concentración intracelular de la molécula fungicida.- Los mecanismos para alcanzar este efecto pueden ser muy variados. Estudios realizados en el área de la Micología Médica sobre Candida albicans. han planteado algunas hipótesis que podrían explicar el origen metabólico de la resistencia a los triazoles.

En primer lugar, se ha planteado que la causa de este fenómeno puede estar asociada a un incremento en la expresión de la proteína transportadora CDR1, la cual pertenece a una superfamilia de transportadores ATP-dependientes que operan sobre distintos tipos de drogas (30). Este transportador expulsa el ingrediente activo del fungicida fuera del hongo, reduciendo de esta forma la concentración y la actividad del mismo. Este mecanismo es también planteado como posible responsable de algunos casos de resistencia a la terbinafina (Alilamina) y amorolfina (Morfolina) (30).


Otra hipótesis similar también ha sido reportada. Ésta supone la sobre-expresión de un gen llamado BENr (también llamado CaMDR1) que codifica al transportador Benr. Este transportador pertenece a otra superfamilia de transportadores metabólicos de drogas, y el incremento de su actividad produce el mismo efecto observado con CDR1 (30).
Estas hipótesis se fundamentan en que en varios estudios se ha logrado correlacionar la reducción de la concentración intracelular de varios triazoles con el incremento de la concentración del ARNm correspondiente a genes codificadores de proteínas transportadoras; como ya se dijo, con esto se activa un sistema de bombeo de moléculas de fungicida hacia el exterior del hongo, reduciendo de esta forma la eficacia del fungicida (30).


  1. Activación de vías metabólicas alternativas que satisfagan la deficiencia de ergosterol.- En otro estudio, también realizado con Candida albicans, se observó que cepas resistentes al Ketoconazol contenían altas concentraciones de fecosterol intracelular; estas altas concentraciones sugieren una reducción de la actividad de la enzima -5,6-desaturasa (30).

En presencia de Ketoconazol, estas cepas acumulan 14--metilfecosterol, el cual podría llegar a reemplazar parcialmente los requerimientos de ergosterol necesarios para mantener la viabilidad del hongo (30), de forma que debido a la actividad del fungicida, no sólo la esterol-14-demetilasa es inhibida, sino que también lo es la -5,6-desaturasa, con lo que se activa una vía alterna que permite que la estructura de la membrana del hongo no sea totalmente afectada por la falta de ergosterol y consecuentemente, el hongo mantenga su viabilidad fisiológica.


Este fenómeno ha sido también observado en Saccharomyces cerevisiae, en donde luego de haber perturbado el gen codificador de la enzima esterol-14-demetilasa (CYP51), la levadura sólo fue viable cuando ocurrían defectos en la actividad de la -5,6-desaturasa (30).
No obstante, este mecanismo aún no ha sido satisfactoriamente validado, puesto que la inactivación del gen codificador de la -5,6-desaturasa debería producir un efecto similar al descrito inicialmente, pero tal efecto no ha sido observado experimentalmente (30).


  1. Modificaciones estructurales o Incremento de la actividad del Citocromo P-450.- Finalmente, otros mecanismos que se plantean para explicar la expresión de resistencia a los fungicidas triazoles en los hongos es la amplificación de la actividad de los genes codificadores del Citocromo P-450 (CYP) y modificación estructural del Citocromo P-450 (30).

En lo que respecta a la amplificación de los genes CYP, se ha observado que no sólo este gen es el que se amplifica sino que probablemente, todo el cromosoma que los contiene lo hace (30). El amplificarse el gen CYP que codifica a la esterol-14-demetilasa, esta enzima incrementa también su actividad, reduciendo la efectividad del fungicida. Paralelamente, se ha observado que cuando este gen se amplifica, la síntesis de ergosterol también aumenta, no sólo a partir del Lanosterol, sino también a través de otras vías a partir de mevalonato, escualeno y acetato, debido a la amplificación de otras enzimas (e.g. oxidoescualeno-ciclasa) (30).


Por otra parte, en estudios realizados en Candida albicans y Ustilago maydis se ha observado resistencia al Ketoconazol, Itraconazol y Fluconazol, en el primer organismo; mientras que en el segundo, se ha expresado resistencia al Triadimenol (30). En ambos casos, se ha planteado que la aparición de dicha resistencia se debe a modificaciones estructurales en la esterol-14-demetilasa que reducen la afinidad entre la enzima y los triazoles.
No obstante, en un experimento con C. Albicans se observó que luego de resembrar las cepas resistentes en un medio libre de fungicidas, la afinidad entre el Citocromo y los Triazoles se restableció, indicando que la resistencia expresada a través de este mecanismo puede ser reversible (30).
En la siguiente tabla 3 se observa un resumen de los principales mecanismos de resistencia anteriormente señalados.

De los mecanismos anteriormente señalados, es importante notar que debido a su variabilidad y a que hasta ahora las cepas resistentes han sido consideradas como tales únicamente por una reducción significativa de su sensibilidad al triazol, el patrón de resistencia aplicable en el caso de esta clase de fungicidas es el Patrón de Resistencia de Pasos Múltiples, referido a una expresión Poligénica (4). En cualquier caso, es muy difícil determinar el aporte individual de cada gen al mecanismo de resistencia global, pero para el caso de los triazoles (como se puede notar en los párrafos anteriores) existe cierta evidencia que vincula un gen particular con un efecto adecuadamente identificable (4,30).


Por otra parte, también en el caso de los triazoles, es importante notar también que en ocasiones un gen asociado a un mecanismo de resistencia no siempre expresa un efecto aditivo a la expresión global, sino que en ocasiones este efecto puede ser sinergista, potenciando únicamente la expresión de otro mecanismo puntual (4).
TABLA 3

POSIBLES MECANISMOS DE RESISTENCIA A FUNGICIDAS TRIAZOLES

Organismo

Fungicida

Posible Mecanismo(s) de Resistencia

Candida albicans


Ketoconazol

Fluconazol

Itraconazol


Reducción de la concentración intracellular del fungicida (CDR1, Benr)

Vía metabólica alterna -5,6-desaturasa (solo observado sobre Ketoconazol)

Modificación del sitio activo (esterol-14-demetilasa)

Candida krusei

Fluconazol

Reducción de la concentración intracelular del fungicida (CDR1, Benr)

Candida glabrata

Fluconazol

Ketoconazol

Itraconazol


Reducción de la concentración intracelular del fungicida (CDR1, Benr)

Amplificación del gen CYP, incremento de la actividad de esterol-14-demetilasa

Ustilago maydis

Triadimenol

Modificación del sitio activo (esterol-14-demetilasa)

Cryptococcus neoformans

Fluconazol

Amplificación del gen CYP, incremento de la actividad de esterol-14-demetilasa

Aspergillus fumigatus

Fluconazol

Reducción de la concentración intracelular del fungicida.

Modificada. Vanden Bossche, H. Mechanisms of Antifungal Resistance. Revista Iberoamericana de Micología. No. 14. 1997

La variabilidad debida al carácter poligénico de la resistencia a los fungicida triazoles antes mencionada se puede notar en la Figura 2.4, dónde se observan dos patrones de resistencia distintos para dos fungicidas triazoles sobre el mismo hongo (Rynchosporium secalis) (5).

FIGURA 2.4

SENSIBILIDAD DE Rynchosporium secalis AL TRIADIMENOL Y PROPICONAZOL

Modificada. Brent, K, Hollomon, D. Fungicide Resistance: The Assesment of Risk. 1998.


Finalmente, otro aspecto determinante de los distintos mecanismos de resistencia a los Triazoles, es la manifestación de resistencia cruzada. La resistencia cruzada implica la posibilidad de que un organismo que haya expresado un mecanismo de resistencia a una determinada sustancia sea también resistente a otra gracias a este mismo mecanismo.
En este sentido, actualmente se conoce que los Triazoles, de forma general, exhiben todos resistencia cruzada en entre ellos (23). Por otra parte, también se han reportado casos en los que los triazoles exhiben resistencia cruzada negativa (el fenómeno inverso) con otros fungicidas, principalmente de la clase de las Morfolinas (30).
A pesar de lo antes mencionado, existe un reporte de una investigación médica desarrollada sobre Hystoplasma capsulatum en la que se observó resistencia cruzada negativa entre dos fungicidas triazoles, el Fluconazol y el Itraconazol, aunque los autores del reporte señalan que las causas de este fenómeno deben más ampliamente estudiadas (30).
Además de los distintos casos de resistencia cruzada, los triazoles pueden manifestar relaciones antagonistas o sinergistas con distintos compuestos no fungicidas (e.g. compuestos lipofílicos, detergentes, surfactantes, inhibidores de la respiración). Teniendo en cuenta esto, se puede confundir un caso de pérdida de sensibilidad hacia determinado triazol con una sencilla relación de antagonismo con algún compuesto presente en el entorno de aplicación.
Los efectos antagonistas que un compuesto puede causar en los triazoles pueden deberse a varias causas, dependiendo del antagonista, pero las más comunes son la formación de complejos antagonista-fungicida o la inducción de cambios en la membrana del hongo que disminuyan la tasa de absorción del fungicida (6). Los principales compuestos antagonistas de los triazoles son los compuestos lipofílicos, detergentes no iónicos, cloruros de Calcio o Magnesio, entre otros (6).
Por otra parte, los principales agentes sinergistas de los triazoles son el Cloruro de Hidrógeno, el Hidróxido de Sodio, los surfactantes catiónicos y aniónicos, y los inhibidores de la respiración celular (6). El efecto sinergista que estos compuestos pueden expresar sobre los triazoles se debe a distintas causas, las cuales dependen del compuesto; no obstante, se pueden destacar tres principales causas: el incremento de la solubilidad del fungicida que mejora la absorción de este por parte del hongo, la modificación de las propiedades de la membrana que aumentan la afinidad para la absorción del fungicida, y finalmente la inhibición de los mecanismos de transporte activo que expulsan las moléculas fungicidas del interior del cuerpo del hongo (6).

1 En la sección 1.4 se aborda más detalladamente la evolución del problema de la resistencia a los Triazoles en Mycosphaerella fijiensis.



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