Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por -aminoácidos unidos linealmente por enlaces peptídicos



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Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008.
Trabajo Práctico Nro. 6: PROTEINAS
Objetivos:

  • Demostrar el efecto de metales pesados, sales, ácidos fuertes, y calor sobre la estabilidad de las proteínas en solución acuosa y demostrar a través del uso de test estándares la detección de proteínas presentes en distintos materiales.

  • Determinar la concentración proteica de 4 muestras complejas utilizando el método de Bradford


Introducción:

Las proteínas son compuestos biológicos constituídos principalmente por -aminoácidos (aa) unidos linealmente por enlaces peptídicos. Las proteínas conocidas están formadas por una combinación de 20 aminoácidos unidos en una secuencia determinada, propia de cada proteína (estructura primaria).

Una de las propiedades más características de los aminoácidos es su naturaleza anfótera. En soluciones acuosas pueden encontrarse como iones bipolares o zwiteriones, los cuales en presencia de ácidos se comportan como bases y toman protones mientras que en presencia de bases se comportan como ácidos cediendo protones.

El trabajo práctico contará de dos partes:

1.- Reacciones de precipitación y reconocimientos de proteínas.

2.- Cuantificación proteínas según el método de Bradford.


1.- REACCIONES DE PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS.
Las moléculas proteicas pueden reaccionar unas con otras, también con iones de carga opuesta y con agua por ser ésta un dipolo, ya que una proteína tiene muchos grupos correspondientes a sus cadenas laterales, cargados positiva o negativamente (dependiendo del pH del medio en que se haya disuelta). Tendremos por lo tanto, interacción proteína-proteína, proteína-H2O, proteína-ión.

Si la interacción proteína-proteína es grande y la interacción proteína- H2O es pequeña, la proteína será insoluble. Si la interacción proteína - H2O es alta, entonces la proteína tenderá a solubilizarse (altamente solvatada). Cualquier condición que aumente la interacción proteína-proteína o disminuya la interacción proteína- H2O disminuye la solubilidad de las proteínas (le quita la capa de solvatación).




  • Precipitación por salado: grandes cantidades de una sal muy soluble agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteína- H2O porque le quita la capa de solvatación, predominará la interacción proteína-proteína y se producirá la precipitación. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para cualquier proteina, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas.

Comúnmente se usa sulfato de amonio (NH4)2SO4 para tal fin, a causa de su gran solubilidad. La adición gradual de ésta sal permite el fraccionamiento de una mezcla de proteínas, las cuales son precipitadas pero no desnaturalizadas, entonces un exceso de agua, por encima del punto de precipitación, permite solubilizar nuevamente las proteínas.


  • Efecto del calor: el calentamiento de las proteínas en soluciones neutras produce alteraciones en sus propiedades, tales como disminución de la solubilidad, pérdida de la actividad específica, pérdida de sus características de cristalización. Conjunto de alteraciones que se las conoce como desnaturalización.




  • Formación de sales:

Efecto de metales pesados: las proteínas son precipitadas de sus soluciones por sales de metales pesados, por combinación del ión metálico con la forma aniónica de la proteína. Las sales comúnmente usadas son HgCl2 ó ZnCl2.

Efecto de los ácidos: las proteínas pueden precipitarse de la solución acuosa por la adición de ciertos ácidos tales como tricloroacético (TCA), perclórico, clorhídrico, los cuales forman con las proteínas sales insolubles.

PARTE PRÁCTICA:
A) Reactivos:
Solución de TCA al 5% (v/v en H2O)

Solución saturada de (NH4)2SO4 (o la sal)

Solución de HgCl2 (1% p/v en H2O)
B) Técnica:
1.- En una serie de 8 tubos de ensayo, colocar 1.5 ml de la muestra en 4 tubos y igual volumen de H2O en los restantes.

2.- Efecto de sales: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar el mismo volumen de la solución saturada de (NH4)2SO4. Mezclar bien y colocar en baño de hielo. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O. Cómo explica lo ocurrido?

3.- Efecto del calor: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, calentar CUIDADOSAMENTE a la llama del mechero. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.

4.- Efecto de metales pesados: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar gota a gota solución de HgCl2 1%. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.

5.- Efecto de ácidos: A 2 tubos, uno conteniendo la muestra y el otro H2O, agregar gota a gota solución de ácido TCA al 5%. Observar y registrar el resultado. Luego agregar 5 ml de H2O y observar lo que ocurre.
2.- CUANTIFICACIÓN PROTEÍNAS SEGÚN EL MÉTODO DE BRADFORD.
La cuantificación de proteínas de manera exacta, confiable y reproducible es una de las cuestiones experimentales mas frecuente en un laboratorio bioquímico. Esto se debe a que la mayor parte de los datos experimentales son normalizados por la cantidad de proteínas presentes en la muestra analizada.

Se han desarrollado varios métodos espectroscópicos para la cuantificación de proteínas. Todos ellos se mantienen vigentes, y se usan de acuerdo a la necesidad del experimentador.

El más simple de estos métodos es la medición de la absorbancia intrínseca de una proteína en solución en la región UV (280 nm). Esta técnica se basa en la absorción intrínseca de los residuos aromáticos que forman parte de la proteína y por ello para cada proteína se debe conocer su coeficiente de extinción molar () ya que éste varía de acuerdo a la composición de aminoácidos. Aunque este método es muy exacto y muy simple, solo puede ser empleado para proteínas puras de () conocido, en soluciones libres de sustancias interferentes en la absorción en UV, y se debe disponer de cubetas de cuarzo.

Además existen 2 métodos basados en la formación de complejos con cobre: i) método de Lowry y ii) método de Ácido Bicinconínico. Ambos métodos se basan en la reducción del Cu2+ a Cu1+ por parte de las amidas. Esto los hace métodos bastante precisos pero requieren de la preparación de varios reactivos que deben ser cuidadosamente mezclados durante el ensayo, incubaciones muy precisas a temperaturas elevadas, y los compuestos coloreados resultantes son bastante inestables. Ambos ensayos además presentan interferencias con diversas sustancias que suelen estar presentes en muestras biológicas como lípidos, buffers, agentes reductores y detergentes. Esto conlleva a la preparación de numerosos blancos de reacción para descartar dichas interferencias.

Por último, el método de Bradford es el más empleado para la determinación de proteínas en una muestra compleja. Este ensayo se basa en el corrimiento del máximo de absorción del colorante Azul de Coomasie G-250 desde 465 nm a 595 nm cuando esta unido a proteínas. Bajo condiciones fuertemente ácidas, la forma estable del colorante es la doblemente protonada que absorbe a 465 nm. Mientras que al unirse a proteínas la forma estable es la desprotonada, de color azul que absorbe a 595 nm. La interacción proteína-colorante es estabilizada por interacciones iónicas y sobre todo por interacciones hidrofóbicas. Por esto, la relación entre la aparición de color y concentración de proteínas dependerá también de la composición aminoacídica de la proteína en estudio. La desventaja que presenta es que la relación color/concentración en lineal en un pequeño rango (1 – 25 g/mL).

Como se puede deducir, no existe un método ideal o de referencia, pero de los métodos mencionados el más empleado es el de Bradford por su rapidez y simplicidad y es el que se desarrollará en el TP.


A) Reactivos:


  • Solucion estándar de albúmina sérica bovina: Se utilizará una solución madre de 100 g/mL con la cual se realizará la curva de calibrado del método.

  • Reactivo de Bradford: Disolver 20 mg de Coomasie G en 10 ml de etanol, agregar 20 ml de Acido fosfórico y diluir a 200 ml con H2O. Filtrar y conservar a 4 C a resguardo de la luz en frasco color caramelo.

B) Técnica:
Cada grupo realizará una curva de calibrado de albúmina en las concentraciones finales indicadas en la tabla, y tendrá una solución problema a la cual determinar la concentración a partir de la curva de calibrado construída.



  1. Rotular 10 tubos eppendorf como B, T2, T4, T6, T8, T10, P1, P2, P3, P4. Los datos de estas muestras serán empleados en el TP siguiente.

  2. Colocar en cada tubo la cantidad de H2O y solución Standard de albúmina según se indica en la tabla.

  3. Agregar 1 mL del reactivo de Bradford y agitar en vortex.

  4. Incubar 5 minutos (y no más de 15) a temperatura ambiente.

  5. Leer absorbancia a 595 nm.

  6. Preparar la curva de calibrado graficando la DO corregida de cada patrón en función de la concentración de los mismos.

  7. Determinar la concentración de proteínas en la muestra problema utilizando la curva elaborada anteriormente.



Tubo

Standard BSA

H2O

Muestra

DO

DO corregida

B

0 L

100 L

0 L







T2 (2 g)

20 L

80 L

0 L







T4 (4 g)

40 L

60 L

0 L







T6 (6 g)

60 L

40 L

0 L







T8 (8 g)

80 L

20 L

0 L







T10 (10 g)

100 L

0 L

0 L







P1 (Problema)

0 L

90 L

10 L







P2 (Problema)

0 L

90 L

10 L







P3 (Problema)

0 L

90 L

10 L







P4 (Problema)

0 L

90 L

10 L














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