Laboratorio de hongos: visualización y tinción semana 9



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LABORATORIO DE HONGOS: VISUALIZACIÓN Y TINCIÓN

SEMANA 9


  1. MARCO TEÓRICO:




  1. Propiedades generales de los hongos:

Los hongos se pueden clasificar morfológicamente en levaduras y hongos filamentosos. Las levaduras son células individuales mucho más grandes que las bacterias y comúnmente ovales, pero algunas son elongadas o esféricas. Cada especie tiene una forma que la caracteriza, pero aún en cultivo puro la variabilidad en cuanto a tamaño y forma es considerable de manera individual. Las levaduras no poseen flagelos ni ningún otro medio de locomoción. En el agar, los hongos levaduriformes producen colonias de aspecto suave, brillante y plano, tal como lo hacen las bacterias. Este tipo de colonias son muy diferentes a las colonias dispersas, levantadas, rugosas y algunas veces con pigmentación variada, que caracteriza a los hongos filamentosos.


Figura 1. Morfología de las levaduras.


Ejemplo de colonias levaduriformes.
A diferencia de las levaduras unicelulares, los hongos filamentosos son un solo organismo multicelular, que al microscopio luce compuesto de muchos filamentos. Al verlos en alto poder es posible distinguirles varias partes:

  1. El talo, o cuerpo del hongo, que está compuesto de micelio y esporas de reproducción. Las esporas de las bacterias, a diferencia de las de los hongos, servían como medio de resistencia para dispersarse oponiendo resistencia a las condiciones ambientales, y no como forma de reproducción.

  2. Todo el conjunto de filamentos es llamado micelio, pero cada filamento en particular es denominado hifa.

  3. Cada hifa es una larga cadena de células unidas unas con otras, a través de una pared compuesta de quitinas, celulosas y glucanos. Las hifas pueden categorizarse en cenocíticas o septadas. Las hifas cenocíticas no poseen esta pared divisoria, siendo todo el micelio una serie de filamentos sin otra característica relevante más que lo único que puede observarse son núcleos espaciados a diferentes distancias. Mientras que las hifas septadas poseen pared divisoria o “septo” formando así células unidas a otras, los núcleos de cada células septada están a una distancia contante uno del siguiente, y en cada pared hay un poro a través del cual el citoplasma de las células de la hifa circula libremente de una a otra y permite que el filamento se extienda mediante la generación de otras células septadas. Visto desde otro punto de vista, un antimicótico puede m atar a todo el micelio, sea éste cenocítico o septado.


Figura 2. Hifas septadas


Figura 3. Comparación de hifas cenocíticas (A) y septadas (B)




  1. Algunas hifas están embebidas en el medio, cuando se usa uno sólido como Sabouraud o Mycocel, o en medios como el pan, o el suelo, y eso le da soporte al talo y además nutrientes. Estas hifas especializadas se denominan rizoides, ya que funcionan como una raíz. Así entonces, las hifas crecen por elongación en cuyo fragmento final hay un núcleo capaz de producir nuevas células. A diferencia de las bacterias, el tiempo de crecimiento de un hongo en el laboratorio puede tardar algunas semanas, como mínimo unas 2 para poder identificarlo hasta especie. Las hifas reproductivas pueden crecer hacia arriba venciendo la gravedad, de tal manera que la estructura que contiene las esporas puedan diseminarse al contacto con las corriente de aire, o de agua, en los hongos acuáticos. Como excepción, las esporas acuáticas sí pueden poseen filamentos de locomoción. El ejemplo patógeno, que en Costa Rica tiene importancia veterinaria pues se reportan casos en caballos, es el llamado “hongo de los pantanos” o “cáncer de los pantanos”, aunque en otros países hay casos en humanos. El nombre del agente es Ptyum insidiosum que parasita únicamente plantas acuáticas y los esporangios maduros liberan zoosporas que nadan activamente buscando un hospedero.

Cada espora en vías de germinación genera un tubo de germinación, corto, similar al comienzo de una hifa cuya extensión se convertirá finalmente en un nuevo talo. Las hifas que no están especializadas en realizar alguna labor simplemente crecen en la superficie del sustrato y son llamadas hifas vegetativas. Otras hifas pueden organizarse para formar estructuras más grandes y visibles, como los hongos del bosque, los que crecen en forma de oreja en el tallo de un árbol, entre otras.

Muchos hongos patógenos exhiben lo que se conoce como dimorfismo, tanto en las levaduras como en los hongos filamentosos. La fase levaduriforme está presente cuando el hongo actúa como parásito produciendo la enfermedad, y la fase filamentosa o micelial aparece cuando el hongo se comporta como saprófito en su hábitat natural o en medio de cultivo in vitro en el laboratorio a temperatura ambiente. La demostración de dicho dimorfismo es crucial en la identificación del patógeno a nivel microbiológico. Los hongos cenocíticos constituyen la excepción, ya que ellos no son dimórficos. La otra excepción es Candida sp. pues en los tejidos infectados pueden aparecer formas miceliales, levaduras y cadenas de éstas conocidas como pseudomicelio

Cuando se habla de hongos como agentes infecciosos, usualmente se hace referencia a ellos como los patógenos oportunistas por antonomasia. Esto se debe a que su potencial de virulencia, en la mayoría de los casos, es tan bajo que no causan cuadros importantes en hospederos que no presentan factores predisponentes importantes de inmunidad. Por ejemplo, debido al VIH/SIDA y otras condiciones indirectamente por el avance de la medicina que han repercutido en:


  1. El control de las enfermedades agudas, que antes causaban la muerte temprana de los individuos, produjo un aumento de la población mayor y susceptibles.

  2. La prolongación de la vida de pacientes que sufren cuadros clínicos y malignos.

  3. Los tratamientos inmunosupresores para evitar el rechazo de órganos trasplantados.

Así, al haber cada vez más hospederos con un sistema inmunológico deficiente, éstos se tornan presas fáciles de agentes oportunistas. Los hongos son el mejor ejemplo de ello. Sus esporas pueden estar en el ambiente normal y entran al organismo por inhalación o a través de pequeños traumatismos, como suele ocurrir con las infecciones rino-cerebrales y pulmonares. Con base en el tipo de esporas sexuales con que se reproducen los hongos, el Reino Fungi se divide en 3 Filos:
Basidiomycota: producen basidiosporas sexuales en la superficie del basidium, las setas o “sombrillitas” de los hongos. Este grupo incluye los hongos comestibles y las setas que se observan en el campo; además Cryptococcus neoformans, el agente del cuadro pulmonar o generalizado denominado criptococosis.
Ascomycota: se reproducen por ascosporas, incluye dermatofitos (productores de pie de atleta y tiñas) a los cuales se les conoce la fase sexual; además están los patógenos Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis.
Zygomycota: Tienen micelio cenocítico, esto es sin septos y se reproducen por zygosporas. Incluye patógenos oportunistas conocidos como mucorales o zigomicetes.
Por otro lado, existe un grupo de hongos denominados Mitosporic fungi que etimológicamente significa “hongos que se reproducen por esporas provenientes de mitosis”. Anteriormente este grupo fue considerado un cuarto filum denominado Deuteromyces o Fungi imperfecti; pero los organismos que incluyen no tienen relaciones filogenéticas entre sí, por lo que solo constituyen un grupo, a manera de baúl para recoger todos aquellos hongos que no se pueden clasificar porque no se conocen sus esporas sexuales, como por ejemplo Candida albicans.

Figura 4. Estructuras reproductivas de cada filo de importancia médica.


Tipos de esporas. Macroconidias.



Tipos de esporas. Microconidias.


Estructura excepcional de Candida sp.




  1. RECONOCIENDO TIPOS DE MICELIO Y ESPORORAS (TALO). “Llevar resumido en bitácora”

De las placas proporcionadas distinga si el micelio del hongo es hialino (blanco) o fumagoide (oscuro o negro), A éstos últimos también se les conoce como fuliginosos o dematiáceos, donde Dematiatieacea es una gran familia que abarca a todos los hongos con micelio con color.



Para la visualización de estructuras, proceda a hacer el montaje del hongo para ser visto al microscopio. Observe las esporas, dónde están contenidas, están dispersas, se encuentra dentro una estructura globosa llamada conidióforo, o estás íntimamente unidas a los septos del micelio. El procedimiento es el siguiente:


  1. Antes de ir al laboratorio, compre una bolsita de cloro de cualquier marca, ya que el hipoclorito de sodio es el único que inactiva las esporas de los hongos, no el alcohol. Puede llegar la bolsita y en el laboratorio, usando guantes, proceda a cortar una esquina.

  2. Remoje una toalla de papel disponible en el laboratorio, coloque unas tres franjas una sobre otra y proceda a enjutarlas con el cloro hasta que se note que estén bien humedecidas. Colóquese una mascarilla obligatoriamente y guantes.

  3. A continuación encienda el mechero de alcohol en una de las esquinas del papel toalla, para que la convección no aleje las esporas del lugar de inoculación.

  4. Use una asa micológica, o sea, para hongos, que son las que tiene el extremo de metal en forma de L.

  5. Coloque, tanto antes de tomar una parte de la colonia y ponerla en el portaobjetos, como una vez finalizado el proceso, el asa en la llama anaranjada hasta ver que se ponga incandescente, y deje enfriar 3 o 4 minutos.

  6. Tome 2 o 3 portaobjetos, dependiendo de las estructuras variadas que desee observar, y cloque en cada uno 3 gotas de Azul de Lactofenol. El Azul de lactofenol, tiñe los hongos hialinos, y los neutraliza, por lo que una vez colocados allí dejan de ser virulentos. Para los hongos oscuros o de color, use al contrario un medio sin color, esto es, el KOH 10%, que también neutraliza la virulencia del hongo y además ayuda a deshacer la materia orgánica que acompaña al hongo como lo es el agar, y en muestras clínica ayuda a despejar las hifas y esporas de las escamas de la piel, afloja la uña, elimina restos orgánicos.

  7. Ahora tome la placa que contiene el hongo y colóquela en el centro de la toalla con cloro y ponga a la par los portaobjetos.

  8. A diferencia de la bacterias, en las que uno toma solo de la parte superficial de la colonia, para tomar un hongo debe clavar el asa en el L, pues para eso es la forma, y una vez clavada la punta metálica dentro de la colonia de tal forma que sienta que atravesó el agar, haga tracción hacia adelante sin llevar mucho micelio, solo el justo para que se remoje y quepa dentro de las gotas de Azul de Lactofenol o KOH, según sea el caso.

  9. Una vez puesta una parte de la colonia del tamaño de medio frijol, con la misma asa, aplaste el agar principalmente junto con el micelio tratando de que se aplane pero de manera gentil, de lo contrario las estructuras micótica como los esporangios, clavulosporas, conidios, se destruirán por acción mecánica rápida. El consejo sería comience a aplanar de un extremo la colonia a otro. Muchos dirán, ¿pero por qué no simplemente tomar de la parte blanca superficial de la colonia? La respuesta es muy sencilla, en los hongos, a diferencia de las bacterias, tanto la colonia como los rizoides o partes de él que crecen bajo la superficie del agar son importantes en taxonomía, tan es así que el color de una colonia, por ejemplo de Trichophyton rubrum (causante de hongos en las uñas) tiene una colonia no muy llamativa por arriba y color vino por el revés del agar.

  10. Si observa que se absorbió mucho Lactofenol o mucho KOH, coloque un par de gotas más. Ponga el cubreobjetos encima y con cuidado ponga la preparación unos tres segundos a la llama y retire. Vuélvalo a hacer unas dos veces más. Ponga sobre el papel toalla para enfriar.

  11. Ponga la lámina en el microscopio. Use el lente de 10X (amarillo) y pase luego a 40X. No se usa aceite de inmersión para esta clase de preparación.

  12. Anote todas las observaciones.




  1. AISLANDO MIS PROPIOS HONGOS QUERATINOFÍLICOS. “Llevar resumido en bitácora”




  1. En frasco de tapa ancha, como los que se venden en las farmacias para recolectar muestras de orina, coloque hasta la mitad tierra de tipo humus, no polvo, sino tierra que se ve húmeda, como de macetas, zonas cercanas a riachuelos, la tierra que hay bajo los árboles. Allí se encuentran las hifas de los hongos queratinofílicos (llamados así porque su sustrato alimenticio fundamental es la queratina).

  2. La queratina está presente en todo el reino animal, incluidos los humanos. Por lo tanto, corte ligero mechón de cabellos, o corte unos cabellos de un perro y otro animal, plumas de aves, pero lo más efectivo es el cabello y en especial las uñas. (Podrían pedir mechones de pelo en una peluquería, por ejemplo, si se les llegara a dificultar) De ahí que en los laboratorios, para hacer que crezcan estos hongos, muchas veces usamos pelo de la crin de los caballos, y el hongo crece fabulosamente. Tome el cabello, puede usar guantes o no, es indiferente, y sumerja las puntas del cabello dentro de la tierra e incluso puede humedecer más la tierra con un poco de agua corriente, sin que rebalse ni se haga un charco. Ningún hongo les “va a brincar desde la tierra al brazo”. Por el contrario, algunos géneros tardan entre 10 a 15 días para fabricar la colonia, aun cuando privan las condiciones óptimas.

  3. Puede dejar el frasco con la tierra y cabellos rotulado en el laboratorio, pero no es la primera vez que se los roban o desaparecen. Cerrado el frasco y resguardado dentro de otra bolsa, no hay ningún riesgo de llevarlo a la casa. Solamente colóquenlo en un lugar fresco y lejos del sol, por las siguientes dos semanas.

  4. El hecho que no vean colonias blancas o del color “x”, no implica que el hongo ha crecido. De hecho no va a crecer si lo que agregan a la tierra es keratina comercial de la que se vende en suplidoras de belleza. Deber ser queratina procedente de un organismo vivo, como se indicó previamente.

  5. El último paso, va a ser hacer el pasaje del hongo al medio Sabouraud y Mycosel, y hacer la tinción correspondiente según el tipo de talo (hialino o fuliginoso) que hayan obtenido.


AUTOEVALUACIÓN
Selección única:


  1. El cuerpo del hongo, que está compuesto de micelio y esporas de reproducción, se denomina:

  1. Micelio

  2. Conidióforo

  3. Talo

  4. Rizoide




  1. Todas las esporas que produce un hongo son microscópicas y las respiramos desde que nos levantamos hasta el anochecer. Sin embargo la razón por la cual no nos enfermamos a pesar de estar inhalándolas constantemente se debe a que:

  1. no encuentran dentro del organismo un sustrato en el cual anclar los rizoides.

  2. son microorganismos oportunistas y se vuelven virulentos en hospederos inmunosupresos.

  3. no son estructuras que el hongo produce para reproducirse sino para soportar el clima adverso.

  4. son mucho más patógenos los factores de virulencia del micelio que de simples esporas.




  1. Los hongos que se encuentran en el campo y que se comercializan enlatados, los ejemplos macroscópicos de hongos que tienen “sombrilla”, pero cuyo nombre es “basidiocarpo” y de ahí que se agrupen dentro de la división:

  1. Ascomycotina

  2. Basidiomycotina

  3. Zigomycotina

  4. Deuteromycotina




  1. Las hifas cenocíticas se diferencian de las hifas septadas en que las primeras…

  1. se clasifican como Fingi Imperfecti

  2. producen un tipo de filamentos conocidos como pseudomicelio

  3. no poseen esta pared divisoria en la hifa solo núcleos espaciados a diferentes distancias.

  4. poseen pared divisoria formando células unidas a otra con núcleos contante espaciados.




  1. La especie de hongo que más comúnmente se halla ocasionando patología en las uñas se llama:

  1. Candida albicans

  2. Trichophyton rubrum

  3. Trichophyton mentagrophytes

  4. Blastomyces dermatitidis




  1. Para el montaje de un hongo fuliginoso el procedimiento estándar en micología médica establece que debe usarse:

  1. KOH al 10%

  2. Hipoclorito de sodio al 3%

  3. Azul de Lactofenol

  4. Rojo de Fenol




  1. Para el montaje de un hongo hialino el procedimiento estándar en micología médica establece que debe usarse:

A) KOH al 10%

B) Hipoclorito de sodio al 3%

C) Azul de Lactofenol

D) Rojo de Fenol




  1. Para aislar hongos queratinofílicos del suelo de una manera más rápida y efectiva, en los laboratorio de microbiología se usa:

  1. Agar selectivo de Mycosel

  2. Pelo de crin de caballo

  3. Mechón de pelo de una trabajadora del laboratorio

  4. Uñas dentro del agar, sea este un Sabouraud o un Mycosel.




  1. Para hacer el montaje de hongos en un portaobjetos a partir de una placa con dichos en crecimiento, la forma de inactivar todas la esporas que puedan salir en forma de aerosol es:

  1. Usar guantes y mascarillas

  2. Colocar suficiente alcohol etílico al 70% sobre la mesa de trabajo

  3. Trabajar con mechero encendido de un lado y toallas impregnadas de cloro

  4. Esterilizar el asa micológica antes de arrancar una porción de la colonia.




  1. Los agentes productores de “pie de atleta” están clasificados dentro del Phylum:

A) Ascomycotina

B) Basidiomycotina

C) Zigomycotina

D) Deuteromycotina

RESPUESTAS: 1. C – 2. B – 3. B – 4. C – 5. C – 6. A – 7. C – 8. B – 9. C – 10. A
CALIFICACIÓN: número de aciertos = ______________x10 = __________ %
100: Excelente

90: Muy bueno



80: Aceptable

Menos de 80: Vuelva a repasar el capítulo.

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