Guía de laboratorio de Ingeniería Molecular



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Guía de laboratorio de Ingeniería Molecular

Ingeniería Ambiental

Elaborado por:

M. en C. Aida Zamora Contreras

Dra. Margarita Ivonne Garrido Gutiérrez

M. en C. Carmen Calixto Mosqueda










Abril, 2014.

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

REGLAMENTO DE LABORATORIO
Uno de los objetivos del trabajo de laboratorio es que a través de los experimentos y procedimientos aplicados, se adquieran habilidades y destrezas en el manejo de técnicas, de datos, de equipos e instrumentos de laboratorio.
El trabajo en laboratorio requiere disciplina y orden, es necesario que lea cuidadosamente cada una de las prácticas antes de cada sesión. Durante el desarrollo de cada práctica atienda las instrucciones del profesor, ya que de ésto depende la obtención de buenos resultados.
Las normas mínimas de seguridad que debe seguir son las siguientes:
1. Al ingresar al laboratorio, el alumno deberá portar bata blanca debidamente abotonada.
2. Para aprobar el curso de laboratorio deberá cubrir, al menos, el 80 % de asistencia a las sesiones prácticas, así como el 80 % de las prácticas aprobadas.
3. La asistencia con puntualidad al laboratorio es imprescindible, no habrá retardos y tendrá falta quien no llegue a la hora establecida. La lista de asistencia se pasará 15 min después de haber iniciado la sesión.
4. En caso de llegar después de la hora de tolerancia, ya no se le permitirá la entrada y se considerará como inasistencia.
5. Las faltas al laboratorio se calificarán con cero. Éstas se justificarán exclusivamente a través de un memorandum debidamente firmado y sellado por la Subdirección Académica. Para la evaluación sólo se tomará en cuenta la calificación del reporte de la práctica.
6. En el laboratorio se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, puesto que es un lugar de trabajo donde se manejan aparatos, equipos delicados, costosos y, en algunas ocasiones, sustancias peligrosas.

7. Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido comer o fumar dentro del laboratorio.


8. Se debe tener cuidado con el manejo de sustancias y/o microorganismos, por lo tanto, es necesario tomar las debidas precauciones, asegurándose de lavarse las manos al inicio y al final de la sesión de laboratorio.

.

9. Durante la sesión de laboratorio, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo. De igual forma, se prohíbe cualquier interrupción durante la misma.


10. El alumno deberá llenar un formato para solicitar el material de laboratorio, teniendo cuidado de revisar que el material recibido esté en buen estado y en caso contrario, deberá reportarlo al (a la) técnico docente, al momento de entregar el formato con su credencial.
11. Al iniciar la práctica deberá limpiar su mesa de laboratorio con una franela. En caso de trabajar con cepas microbianas, deberá limpiar la mesa con benzal al inicio y término.
12. Una vez terminada la práctica, el material utilizado durante su desarrollo, deberá entregarse limpio y seco.
13. El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por la persona o equipo de personas responsables de él, a más tardar dos semanas antes de finalizar el semestre lectivo.
14. El alumno no deberá abandonar el laboratorio por ningún motivo, antes de que concluya la práctica, a menos que el profesor lo autorice, en caso contrario se le cancelará su asistencia.
15. Ningún alumno podrá permanecer el laboratorio después de concluida la sesión práctica.
16. La entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará condicionada a la autorización y tiempo libre del profesor responsable del grupo.
17. Es obligatorio el uso del Manual de Prácticas de Laboratorio en cada sesión.
18. El reporte de la práctica deberá entregarse una semana después de la discusión.
19. El registro de datos y observaciones de cada práctica deberá hacerse en una bitácora o en el manual de prácticas, si así lo desea el alumno.
Práctica 1
EXTRACCION DE ADN DE CULTIVOS PUROS

REACTIVOS


1. Solución equilibrada de fenol, pH8









Fenol fundido a 68ºC

500 ml

Hidroxiquinolina

10 ml

Tris-Cl, 0,5 M pH 8.O




Tris-Cl, 0,1 M pH 8.O




Beta-mercaptoetanol







  1. Mezclar fenol fundido, la hidroxiquinolina y la sol de Tris-Cl, 0,5M pH 8.O, agitar durante 15 min con un agitador magnético, dejar separa las dos fases y eliminar la fase acuosa.

  2. Añadir un volumen igual de Tris-Cl, 0,1 M pH 8.O agitar durante 15 min con un agitador magnético, dejar separa las dos fases y eliminar la fase acuosa. Repetir las extracciones hasta que el fenol tenga pH 7,8. eliminar la fase

  3. Añadir 0,1 volumen (50ml) de tris-HCl 0,1M pH8,0 más 0,2% de bata-marcaptoetanol, conservar en frasco ámbar, a 4ºC, hasta por un mes.


2. TE pH 8,0.



Tris-HCl pH8,O

10mM

EDTA, pH 8,0

1mM


3. TE 50/20.

EDTA 0,25M

8,0 ml

Tris 1M, pH 8,0

0,02 ml

Aforar a 100 ml






4. CTAB - NaCl (Bromuro de cetil-trimetil amonio)

CTAB (Bromuro de cetil-trimetil amonio)

10,0 g

NaCl 0,7 M

100 ml

Antes de su uso calentar a 65º C durante 10 min (en caso de estar viscosa)





5. SDS 10%.

SDS

10,0 g

dH2O estéril

1,0 ml

Mantener a temperatura ambiente





6. Lisozima al 1%


Lisozima

10,0 mg

Te 50/20

1,00 ml

Preparada el día de su uso





7. Proteinasa K al 2%

Proteinasa K

20,0 mg

dH2O estéril

1,0 ml

Almacenar a -20 ºC





8. RNAsa al 1%

Rnasa

10, mg

dH2O estéril

1,0 ml

Hervir durante 5 min y almacenar a -20º C



Procedimiento



  1. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 min, 5 ml de cultivo en fase exponencial, con D.O. a 640 nm de 0,5.

  2. Lavar la pastilla en 1 ml de TE 50/20.

  3. Centrifugar a 8000 rpm por 3 min, con la ayuda del vórtex resuspender la pastilla en 450 L de TE 50/20.






Agregar 50 L de:

Incubar a 37 ºC por:

Lisozima

30 min

Proteinasa K

15 min

SDS al 10%

30 min




  1. Mezclar por inversión

  2. Adicionar 100 L de NaCl 5M mezclar e incubar a 65ºC por 5min.

  3. Adicionar 80L de solución CTAB-NaCl

  4. Extraer dos veces con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), mezclar y centrifugar a 11000 rpm por 5 min.

  5. Extraer dos veces con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24:1), centrifugar a 11000 rpm por 5 min.

  6. Extraer una vez más con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), mezclar y centrifugar a 11000 rpm por 5 min.

  7. Precipitar en un volumen de isopropanol, dejar reposar 10 min a temperatura ambiente y centrifugar a 11000 rpm por 5 min.

  8. Lavar la pastilla 3 veces con 1 ml de etanol al 70%

  9. Resuspender en agua miliQ estéril, agregar 2 L de RNAsa e incubar a 37ºC por hora.

Cuestionario


Mencione algunas aplicaciones en el área ambiental de las técnicas empleados en esta práctica.
¿Por qué es necesario purificar la muestra de ADN? ¿Qué pasaría si se omitiera ese paso?
Llene la siguiente tabla

Reactivo

¿Qué es?

Aplicación en la técnica

Se puede remplazar con:

¿Qué sucede si se omite?

LISOSIMA













EDTA













FENOL













ETANOL















Realice los cálculos para preparar 100ml las siguientes soluciones.

100mMTris-HCl (Fw 121.14)

100mMEDTA (Fw 372.24)

1,5M NaCl (FW 58,44)

SDS 20% (Fw 88.38)

De la la solución de 1,5M NaCl preparar 50ml de 0,5mM de NaCl.
¿Qué diferencia habría entre la extracción de ADN total y la extracción de un plásmido?
COMO DISCUSIÓN SE LE EVALURÁ UNAS PREGUNTAS REFERIDAS AL ARTICULO DE XUESONG (Et. At; 2009): ISOLATION, IDENTIFICATION OF SLUDGELLYSING STRAIN AND ITS UTILIZATION IN THERMOPHILIC AEROBIC DIGESTION FOR WASTE ACTIVAED SLUDGE.

¿QUÉ SON LOS WAS?
SEGÚN HASEGAWA (EL AL 2000). ¿QUÉ SE RECOMIENDA ADICIONAR EN LUGAR DE ENZIMAS? ¿Y POR QUÉ?
¿DE QUÉ MANERA EXTRAER EL ADN DE LOS WAS? Y ¿CÓMO LA IDENTIFICAN?

MENCIONE LOS RESULTADOS DE LA IDENTIFICACIÓN Y DE LA EXTRACCIÓN

¿QUÉ CEPA EXTRAIDA Y QUE PRODUCE UNA PROTEASA TERMOESTABLE?
Práctica 2
EXTRACCIÓN DE ADN EN MUESTRAS DE SITIOS CONTAMINADOS
Objetivo.

Conocer y entender los principios básicos para poder extraer ADN de muestras de sitios contaminados.


Introducción

Para extraer ADN en muestras se requiere de tres pasos fundamentales que son:



  • Lisis celular, para liberar sus componentes

  • Purificación del ADN.

  • Concentración de la solución de ADN.

Lisis celular.

Las células bacterianas están envueltas por una membrana citoplasmática y rodeada por una pared celular, para liberar los componentes celulares es necesario romper estas barreras, para ello se pueden utilizar métodos físicos, químicos y enzimáticos.

La ruptura física comprende técnicas basadas en fuerzas mecánicas, las más utilizadas son congelamiento-descongelamiento, trituración con molino de perlas, ultrasonicación y molido en nitrógeno líquido, siendo las más empeladas el molino de perlas y el congelamiento- descongelamiento. Se ha encontrado que con el molino de perlas se obtiene mayor cantidad e ADN pero, también se contamina más con ácido húmicos.

La lisis química consiste en exponer a las células a agentes químicos que afectan la integridad de las barreras celulares, este tipo de técnicas emplean mezclas que contienen detergentes, otras emplean NaCl y otras que contienen varios buffers. A estas técnicas se le pueden hacer modificaciones como incremento de temperatura, incubaciones, extracción con fenol y cloroformo y la incorporación de agentes quelantes.

Finalmente la lisis enzimática consiste en utilizar enzimas que digieren compuestos que afectan la rigidez de la pered celular. Se han empleado enzimas como la lisosima, la proteinasa K, la acromopeptinasa y la proteinasa E, siendo la más empleada la lisosima.
La extracción de ADN de sitios contaminados se puede realizar ya sea aislando primeramente las células de la matriz antes de lisar las células o bien lisar las células sin sepáralas de la matriz. Se ha observado que con la lisis directa se obtiene mayor cantidad de ADN
Purificación de ADN.
Al romper las células bacterianas se liberan ADN, proteínas y RNA principalmente. Cuando se quiere purificar ADN se dice que los otros componentes son contaminantes. Existen varios métodos para purificar el ADN. La técnica más común para precipitar proteínas en un extracto celular es la adición de fenol o bien una mezcla de fenol y cloroformo.

Concentración de la solución de ADN.


El método más común para concentrar la solución es la precipitación con etanol. Otras formas de precipitar ácidos nucleicos poliméricos es con sales (específicamente cationes) y una temperatura menor a -20ºC.
MÉTODO A.

REACTIVOS:



  1. BUFFER DE EXTRACCIÓN




100mM TRIS.HCI (pH 8,0)

100ml

100mM EDTA (pH 8,0)

100ml

1.5M NaCl







  1. SDS 20%

  2. PEG 30%/NaCI 1,6M

  3. TE

Tris-HCl pH8,O

10mM

EDTA, pH 8,0

1mM




  1. ACETATO DE POTASIO 7,5M

  2. FENOL-CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMILICO (24:24:1)

  3. CLOROFORMO-ALCOHOL ISOAMILICO (24:1)

  4. ETANOL 70%

  5. Proteinasa K al 2%




Proteinasa K

20,0 mg

dH2O estéril

1,0 ml

Almacenar a -20 ºC







  1. RNAsa

Proteinasa K

20,0 mg

dH2O estéril

1,0 ml

Almacenar a -20 ºC



PROCEDIMIENTO




  1. Mezclar 100 g de suelo (peso seco) con 100 ml de buffer de extracción.

  2. Triturar durante 5 min en el mortero previamente enfriado con hielo seco.

  3. Adicionar 10 ml de SDS 20%.

  4. Triturar durante 2 min.

  5. Incubar 65ºC, 1 h.

  6. Centrifugar a 6000g, 10 min

  7. Almacenar el sobrenadante en un vaso de precipitado y tapar

  8. Repetir los pasos del 1 al 6 con el pellet resultado de la centrifugación.

  9. Juntar los sobrenadantes agregar 25 ml de PEG (30%)/NaCl (1,6)

  10. Incubar a temperatura ambiente, 2h

  11. Centrifugar 10000 por 20 min

  12. Resuspender el pellet con 1 ml de TE

  13. Adicionar acetato de potasio (7,5M), hasta obtener una concentración de 0,5M

  14. Poner la muestra en hielo durante 5min

  15. Centrifugar a 16000g 30 min, 4ºC

  16. Extraer dos veces con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) mezclar y centrifugar a 11000 rpm por 5 min.

  17. Extraer dos veces con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24.1)

  18. Extraer una vez con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)

  19. Precipitar el ADN agregando 1 parte de NaCl 5M por cada 25 partes del volumen obtenido de la solución y 2,5 volúmenes de etanol absoluto.

  20. Mezclar perfectamente, incubar 1 h a -20 ºC y centrifugar a 12,000 rpm a 4ºC durante 20 min.

  21. Lavar con 1ml de etanol al 70% (frío) y centrifugar durante 1 min a 12,000 rpm a 4 ºC.

  22. Resuspender el pellet formado con 500 μl de TE.

Método B




  1. Mezclar 50g de suelo con 100ml buffer y 5ml de proteinasa K (5mg)

  2. Incubar a 37ºC por 30 min a 180 rpm

  3. Adicionar 10ml SDS al 20%

  4. incubar a 65ªC por 90 min

  5. Centrifugar a 6000g por 10 min a temperatura ambiente

  6. Precipitar el sobrenadante en un volumen de isopropanol, dejar reposar 10min a temperatura ambiente y centrifugar a 11000 rpm por 5 min

  7. Resuspender el pellet con 1 ml de TE

  8. Extraer dos veces con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) mezclar y centrifugar a 11000 rpm por 5 min.

  9. Extraer dos veces con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (24:24.1)

  10. Extraer una vez con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)

  11. Precipitar el ADN agregando 1 parte de NaCl 5M por cada 25 partes del volumen obtenido de la solución y 2,5 volúmenes de etanol absoluto.

  12. Mezclar perfectamente, incubar 1 h a -20 ºC y centrifugar a 12,000 rpm a 4ºC durante 20 min.

  13. Lavar con 1ml de etanol al 70% (frío) y centrifugar durante 1 min a 12,000 rpm a 4 ºC.

  14. Resuspender el pellet formado con 500 μl de TE.

Cuestionario


Mencione algunas aplicaciones en el área ambiental de las técnicas empleados en esta práctica.
¿Por qué es necesario purificar la muestra de ADN? ¿Qué pasaría si se omitiera ese paso?
Llene la siguiente tabla

Reactivo

¿Qué es?

Aplicación en la técnica

Se puede remplazar con:

¿Qué sucede si se omite?

LISOSIMA













EDTA













FENOL













ETANOL













Discusión
Que diferencias existen entre las dos técnicas empleadas.

Mencione algunas ventajas y desventajas del empleo de estas técnicas

Qué técnica considera que fue la mejor y ¿por qué?

De acuerdo al articulo de Yeates et al. ¿Qué modificaciones se le hicieron a la práctica? ¿De qué manera pueden repercutir a los resultados finales?


Bibliografía:


c

Steffan R. and Atlas R.; DNA Amplification to Enhance Detection of Genetically engineered Bacteria in Enviromental Samples; Applied and Environmental Microbiology, v.54(9):2185-2191.

Yeates C., Gilings M., Davison A., Altavilla N. and Veal D. 1998; Methods for Microbial DNA Extraction from Soil for PCR Amplification; Biological procedures online, tools to discover. 1: 40-47.
Brown T; Gene Cloning, 1990; An Introduction; Segunda edición; Editorial Chapman & Hall;Great Britain



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