Facultad de ciencias veterinarias y ambientales



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UNIVERSIDAD JUAN AGUSTÍN MAZA

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y AMBIENTALES

CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA VETERINARIA



CÁTEDRA DE VIROLOGÍA Y MICOLOGÍA

VIROLOGÍA

TEORICO Nº 1

Temario: Conocimiento de los virus, reseña histórica. La virología como ciencia biológica. Naturaleza de los virus. Definición de virus. Diferencias con otros microorganismos.

Conocimiento de los virus: reseña histórica.

El descubrimiento de la virología precede al concepto de la especificidad de las causas de enfermedades y es altamente dependiente de los descubrimientos iniciales que se realizaron sobre las bacterias.

Existen grandes nombres y descubrimientos que merecen ser mencionados en la presente reseña:


  • Hipócrates, el físico griego y padre de la medicina, quién en el siglo 4, realizó importantes observaciones epidemiológicas sobre muchas enfermedades infecciosas, incluyendo a la rabia.

  • Fracastoro quién en 1546 teorizó que las enfermedades epidémicas se diseminan por una partícula diminuta que se transporta a grandes distancias.

  • Leewenhoek, quién en 1676 observó la primera bacteria en su microscopio.

  • Spallazani, quién en 1775 cultivó por primera una bacteria.

  • Jenner quién en 1796 introdujo la vacuna contra la viruela.

  • Semmelweis y Holmes, quienes en 1840 desarrollaron métodos prácticos de limpieza y desinfección antimicrobiana.

  • Davaine, quien en 1850 quién asoció por primera vez a un organismo infeccioso (bacillus anthrax) con la enfermedad que produce.

  • Darwin, Wallace y Mendel quienes en 1859 revolucionaron los pensamientos sobre genética y evolución.

Louis Pasteur contribuyó profundamente al establecimiento de la virología como ciencia y como parte de las ciencias que estudian las enfermedades infecciosas, virológicas y microbiológicas. Primero, en 1857, mediante el descubrimiento de la especificidad de las fermentaciones microbianas (para elaboración de vinos, cervezas y quesos); luego en 1865 por extender el concepto a las enfermedades infecciosas de los gusanos de seda, y finalmente entre 1877 y 1895 por extender el concepto a las enfermedades infecciosas humanas y animales. En 1885, Pasteur aplicó la primera vacuna de la rabia a un muchacho (Joseph Meister), mordido severamente por un perro con rabia. De esta forma inauguró el comienzo de la era moderna de las enfermedades infecciosas orientadas a la prevención y control de las enfermedades.

Pasteur trabajó junto a Koch, quién descubrió los agentes causales del cólera y la tuberculosis y contribuyó al desarrollo de los métodos de laboratorio en bacteriología.

En el campo específico de la virología existen grandes nombres y descubridores que merecen ser recordados:


  • Beijerinck e Ivanovski, en 1890 descubrieron el primer virus: “el virus del mosaico del tabaco”.

  • Loeffler y Frosch, en 1898, trabajando junto a Koch, descubrieron el primer virus que afecta a los vertebrados: “El virus de la fiebre aftosa”.

  • Reed y Carroll, en 1898 descubrieron el primer virus de humanos: “el virus de la fiebre amarilla” e incentivaron a Salmon, Curtice y colaboradores a descubrir el ciclo de transmisión del mosquito.

  • Remlinger y Riffat-Bay en 1903 descubrieron el virus de la rabia.

  • Ellermann y Bang en 1908 descubrieron el virus de la leucemia aviar, el primer virus causante de cáncer.

  • Landsteiner y Popper en 1909 descubrieron el virus de la polio.

  • Laidlaw y Dunkin en 1926 descubrieron el virus del moquillo canino.

  • Shope en 1931 descubrió el virus de la influenza porcina y Andrewes, Laidlaw, Smith y Burnet en 1933 lo aislaron por primera vez, a tan sólo 15 años de la gran pandemia de influenza, sucedida entre 1918 y 1919, que mató entre 25 a 40 millones de personas.

  • Olafson, Pritchard, Gillespie, Baker y colaboradores entre 1940 y 1950 determinaron la causa de la diarrea viral bovina.

  • Siggurdsson, en la década de 1950 propuso el concepto de enfermedades infecciosas lentas, a partir de sus estudios con el virus de scrapie y maedi/visna en ovejas.

  • Carmichael, Parrish y colaboradores en 1978 descubrieron el virus del parvovirus canino.

  • Montagnier y colaboradores descubrieron en 1984 el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En 1987, Pedersen y colaboradores descubrieron el virus de la inmunodeficiencia felina.

  • Un grupo numeroso de investigadores británicos descubrieron en 1986 el agente de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) y Prusiner descubrió la naturaleza de los priones, el agente etiológico de la EEB, scrapie y enfermedades similares y en 1997 fue reconocido por este trabajo con el premio Nobel en Medicina.

La inmunología y la biología celular y molecular son dos ciencias que se han entrelazado desde sus comienzos con la virología y las ciencias que estudian las enfermedades infecciosas. Estas ciencias también permiten recordar grandes nombres y grandes descubrimientos que influenciaron a la virología veterinaria moderna.

En inmunología:



  • Metchnikoff, Bordet y Erlich descubrieron entre 1883 y 1909 la naturaleza del sistema inmune.

  • Avery y Lancefield, entre 1928 y 1933, desarrollaron los conceptos básicos de diagnostico de las enfermedades infecciosas.

  • Porter, Edelman y Nisonoff en 1959 descubrieron la estructura y función molecular de los anticuerpos.

  • Doherty y Zinkernagel en 1974 descubrieron como el sistema inmune celular reconoce a las células infectadas con virus. Jerne y Burnet ese mismo año, concibieron a la selección clonal como la base de la respuesta inmune. Mientras que Kohler y Milstein en 1975 desarrollaron los primeros anticuerpos monoclonales.

En biología celular:

  • Carrel, Steinhardt, Eagle, Puck y otros investigadores entre 1910 a 1960 desarrollaron los métodos de cultivo celulares.

  • Palade, Claude, Porter y Duve en las décadas de 1960 y 1970 describieron la estructura interna de las células y organelas y sus funciones bioquímicas.

En biología molecular:

  • Avery, Hershey y Chase entre 1944 y 1952 demostraron que el ADN transporta toda la especificidad hereditaria.

  • Watson y Crick en 1953 descubrieron la estructura del ADN y las bases moleculares de la herencia.

  • Nierenberg, Ochoa, Matthaei y Khorana entre 1961 y 1966 descifraron el código genético.

  • Cohen y Boyer en 1973 desarrollaron la tecnología del ADN recombinante.

La virología como ciencia biológica. Naturaleza de los virus.

Los microorganismos unicelulares pueden ser organizados según su tamaño decreciente y complejidad en: protozoos, hongos y bacterias (en estas últimas se incluyen a los micoplasmas, rickettsias y chlamidias). Estos microorganismos tan simples y pequeños son células. Ellos contienen ADN como depósito de su información genética; también contienen ARNs y poseen la mayor parte de la maquinaria necesaria para producir energía y macromoléculas. Estos microorganismos crecen mediante la síntesis de sus propios constituyentes macromoleculares (ácidos nucleicos, proteínas, carbohidratos y lípidos) y la mayoría se multiplican por fisión binaria.



Los virus, sin embargo, no son células y no son microorganismos. No poseen organelas funcionales y son completamente dependientes de la maquinaria de su hospedador para la producción de energía y la síntesis de macromoléculas. Ellos contienen un único tipo de acido nucleico funcional: ADN o ARN, nunca ambos. Difieren de los microorganismos en que su ciclo de vida se compone de dos fases claramente definidas:

  • Fase fuera de su célula hospedadora: los virus son metabólicamente inhertes fuera de su célula hospedadora y esta fase de su ciclo vital participa de la transmisión del virus.

  • Fase dentro de su célula hospedadora: los virus son metabólicamente activos dentro de la célula que los hospeda. Esta fase también se denomina fase “replicativa” y es donde el genoma viral explota la maquinaria de la célula hospedadora para producir una progenie de copias de su genoma (ADN), ARN mensajero viral y proteínas virales (frecuentemente junto con lípidos e hidratos de carbono), los cuales se ensamblan para formar los nuevos “viriones” (virion es la partícula viral completa).

A diferencia de la mayoría de los microorganismos, muchos virus sólo pueden reproducirse si su ADN o ARN genómico ha sido introducido en la célula hospedadora. Las principales diferencias entre los microorganismos unicelulares y los virus se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1. Propiedades de los microorganismos unicelulares y los virus.

Propiedad

Bacterias

Rickettsias

Mycoplasmas

Chlamydias

Virus

> 300 nm de diámetroa

+

+

+

+

-

Crecimiento en medio no vivientesb

+

-

+

-

-

Fisión binaria

+

+

+

+

-

ADN y ARN

+

+

+

+

-

Ácido nucleico infeccioso.

-

-

-

-

-c

Ribosomas funcionales

+

+

+

+

-

Metabolismo

+

+

+

+

-

Sensibilidad a antibióticos

+

+

+

+

-d

aAlgunos mycoplasmas y chlamydias son menores a 300 nm de diámetro.

bChlamydias y la mayoría de las Rickettsias son parásitos intracelulares obligados.

cAlgunos, entre los virus ADN y ARN.

dCon muy pocas excepciones.

Definición de virus.

Los avances en el conocimiento de la estructura de las partículas virales y de los mecanismos mediante los cuales los virus se reproducen en las células hospedadoras, han sido acompañados con un incremento de las definiciones precisas de estos agentes únicos. Entre los primeros agentes patogénicos, caracterizados por su escaso tamaño y su dependencia de organismos hospedadores para garantizar su reproducción, se destacaron a los virus como agentes productores de enfermedades. Las propiedades que definen a un agente viral son:



  • Los virus son agentes infecciosos, intracelulares obligados.

  • El genoma viral consta de ADN o ARN.

  • Dentro de una célula hospedadora apropiada, el virus replica su genoma y dirige la síntesis de otros componentes virales, utilizando los sistemas celulares.

  • La progenie de partículas virales infecciosas, llamadas viriones, se producen por el ensamble de los componentes sintetizados en la célula hospedadora.

  • La progenie de viriones producidos durante el ciclo infeccioso es el vehículo para la transmisión del genoma viral a la célula hospedadora u organismo más cercano, donde nuevamente se desensambla y da comienzo al próximo ciclo infeccioso.


TEORICO Nº 2

Temario: La morfología y estructura del virión. Simetría isométrica, helicoidal y compleja o desconocida. Terminología específica: virión, cápside, capsómero, nucleocápside. Unidades estructurales, envoltura viral, peplómero. Estructura de los ribovirus (virus con ARN) y los deoxirribovirus (virus con ADN).

Morfología y Estructura del Virión

Estructura de la cápside.

El virión o partícula viral completa de los virus más simples consiste en una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) rodeada por una cobertura proteica denominada: “cápside”. La cápside y el ácido nucleico envuelto por ella constituyen la denominada: “nucleocápside” (Figura 1).




Nucleocápside
Envoltura viral

Ácido Nucleico (ADN o ARN)

Cápside

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Figura 1. Estructura de un virión simple.

La nucleocápside de algunos virus se encuentra “envuelta” por lipoproteínas, que constituyen la denominada: “envoltura viral” (Figura 1).

Existen muchas variaciones en estas estructuras y pueden encontrarse varios componentes adicionales en los virus más complejos.

La información novedosa generada en los últimos 10 años, acerca de la estructura y organización de los componente virales de la cápside, han sido obtenidos a través del análisis con cristalografía de rayos-X, por lo que se requiere de una actualización en la terminología utilizada para describir a los viriones. Algunas características pertenecen a las estructuras definidas morfológicamente, otras son componentes moleculares propiamente dichos.

Los “capsómeros” o “unidades morfológicas” son características discernibles (protrusiones, depresiones, etc.) observadas en la superficie del virión mediante microscopía electrónica (Figura 2.A.).

Ácido nucleico

Subunidades proteicas (polipéptidos)

Capsómero


A

B
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Figura 2. A. Microfotografía electrónica de un rotavirus (Obsérvese las depresiones y protrusiones en la superficie del virión.) B. Los capsómeros recubren el material genético del virión formando en conjunto la nucleocápside viral.

Las cadenas de polipéptidos replegadas alrededor del genoma viral comprenden las “subunidades proteicas” del capsómero. El ensamblaje de estas subunidades proteicas comprende a las “unidades estructurales” o “capsómeros”, las que en conjunto determinan las “unidades de ensamblaje”. Estas son los principales intermediarios en la formación de las cápsides virales (Figura 2.B.). Sólo los viriones más simples están formados por subunidades proteicas, que constituyen los productos primarios de la biosíntesis viral. La mayoría de los viriones se construyen por un ensamblaje característico de estas subunidades proteicas, lo que involucra un proceso de síntesis secuencial y modificaciones o pérdida de precursores.

Una necesidad crucial para el ensamblaje de los viriones es la incorporación del ácido nucleico en el virión en formación (Figura 2.B.). Se han identificado varios mecanismos diferentes que conducen este proceso, incluyendo la presencia de “señales de empaquetamiento” en la secuencia genética del ácido nucleico viral.

Simetría del Virión

Debido a motivos relacionados con la economía genética y la progresión evolutiva, los viriones son ensamblados a partir de múltiples copias de un sólo tipo de subunidad proteica, o en algunos casos, unos pocos tipos de subunidades proteicas. La aparición repetitiva de interfases proteína-proteína similares permite el ensamblaje de las subunidades en cápsides simétricas (Figura 3).



http://recursos.cnice.mec.es/biologia/bachillerato/segundo/biologia/ud07/figuras1/fig1b.jpg

Figura 3. Estructura helicoidal de la nucleocápside del virus del mosaico del tabaco. Obsérvese la disposición y el ensamblaje de las subunidades proteicas del capsómero en la formación de la cápside de este virión.

Esta eficiencia en el diseño también depende de los principios propios del ensamblaje, donde las unidades estructurales son aproximadas a su posición mediante un movimiento térmico aleatorio y son fijadas en su lugar mediante enlaces químicos débiles. Los virus presentan diversas formas y tamaños, dependiendo de la forma, tamaño y número de las subunidades proteicas y de la naturaleza de las interfases generadas entre estas subunidades; sin embargo, sólo se reconocen dos tipos de simetría: “helicoidal” e “icosaédrica” (Figura 4).



Capsómero

Cápside

Ácido nucleico

Ácido nucleico

Cápside

ICOSAÉDRICA

HELICOIDAL

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Figura 4. Simetría helicoidal e icosaédrica de los virus.

Simetría Icosaédrica

La simetría encontrada en los virus isométricos es invariablemente la de un icosaedro, una de las cinco formas sólidas, clásicas de la geometría. Los viriones con simetría icosaédrica tienen 12 vértices (esquinas), 30 bordes y 20 caras, cada cara es un triangulo equilátero. Los icosaedros tienen ejes de simetría rotacional de dos, tres y cinco pliegues, las cuales atraviesan sus bordes, caras y vértices, respectivamente (Figura 5.A.).




B

A
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Figura 5. Simetría rotacional de dos, tres y cinco pliegues. A) Las subunidades proteicas de la cápside se ubican alrededor de los vértices o caras de un icosaedro. Un icosaedro tiene 20 triángulos equiláteros arreglados alrededor de la cara de una esfera. Está definido por tener 2, 3 y 5 ejes de simetría (Figura 8. A, B y C). B) La solución de mínima energía libre, es dividir cada triángulo en 4 triángulos y poner una subunidad proteica en cada esquina. Tendremos 12 x 20 subunidades proteicas, por ejemplo, 240 con 12 pentámeros y 30 hexámeros. Obviamente no son equivalentes, pero 180 y los restantes 60 hacen contacto y se dice que son casi equivalentes.

El icosaedro es la solución óptima al problema de construcción, a partir de subunidades repetitivas, de una estructura fuerte acomodando el máximo volumen. Sólo ciertas disposiciones de las unidades estructurales pueden formar caras, bordes y vértices del icosaedro viral. Las unidades estructurales o capsómeros sobre los vértices de los viriones que unen a cinco capsómeros vecinos son llamados “pentones” (Figura 6), mientras que aquellos que están en las caras o bordes y unen a seis capsómeros vecinos son llamados “hexónes” (Figura 7).



SIMETRÍA ICOSAÉDRICA

Capsómero = Pentón

http://pathmicro.med.sc.edu/mhunt/penton.gif

Figura 6. Simetría icosaédrica del adenovirus. Los capsómeros en las 12 esquinas tienen 5 pliegues de simetría e interactúan con 5 capsómeros vecinos, los cuales se conocen como pentones.

SIMETRÍA ICOSAÉDRICA

Capsómero = Pentón

Capsómero = Hexón

http://pathmicro.med.sc.edu/mhunt/hexon.gif

Figura 7. Los virus más grandes contienen más capsómeros. Los capsómeros extras son distribuidos de una manera regular sobre las caras de los icosaedros, los que tienen 6 vecinos y se los denomina hexones.

En los viriones de algunos virus, tanto los pentones como los hexones están formados por los mismos polipéptidos, mientras que en otros virus están formados por distintos polipéptidos. En la figura 8, se observa la distribución de las unidades estructurales (o capsómeros) sobre la superficie de los viriones de tres modelos de virus icosaédricos pequeños.



Figura 8. Un icosaedro observado a través de sus ejes de simetría rotacional de dos (A), tres (B) y cinco (C) pliegues. Las diferencias en el agrupamiento de los polipéptidos de la cápside son responsables de la apariencia característica de algunos virus en particular. D. Cuando los polipéptidos de la cápside se distribuyen en 60 trímeros, las unidades estructurales son difíciles de observar. Este es el caso del virus de la Fiebre Aftosa. E. Cuando los polipéptidos de la cápside se distribuyen en 12 pentones y 20 hexones forman capsómeros voluminosos. Este es el caso del Parvovirus. F. Cuando los polipéptidos de la cápside se distribuyen en dímeros sobre las caras, generan anillos característicos sobre la superficie del virión. Este es el caso de los Calicivirus.

Debido a las variaciones en la distribución de las unidades estructurales sobre los diferentes virus, algunos aparentan tener contornos más hexagonales y otros contornos más esféricos.

Simetría Helicoidal

La nucleocápside de varios virus ARN se ensambla como una estructura cilíndrica, en la cual las unidades proteicas estructurales se distribuyen como una hélice, dándole el nombre de simetría helicoidal (Figura 3 y 4). Lo que permite el ensamblaje simétrico de una hélice es la forma y la presentación repetitiva de las interfases proteína-proteína idénticas. En las nucleocápsides simétricas helicoidales, el ARN genómico forma un espiral dentro de la nucleocápside (Figura 9).



Capsómero

ARN



Figura 9. Estructura helicoidal del virión del virus del mosaico del tabaco. Obsérvese como el ARN genómico forma un espiral dentro de la nucleocápside.

Los virus con simetría helicoidal que afectan a los animales poseen una nucleocápside helicoidal que se enrolla en una cola secundaria y se encierra dentro de una envoltura lipoproteica.



Envoltura viral

Los viriones de muchos virus, miembros de diferentes familias, poseen una envoltura y en la mayoría de los casos se necesita de esta envoltura para garantizar la infectividad del virus. Los viriones recubiertos con esta envoltura adquieren esta capa exterior cuando sus nucleocápsides extruyen a través de una membrana celular. Este proceso se denomina “gemación” (Figura 10).



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Figura 10. Proceso de gemación viral. Muchos virus recubiertos adquieren su envoltura durante el proceso de gemación a través de la membrana plasmática de la célula hospedadora.

Los lípidos de la envoltura viral derivan directamente de los lípidos de la membrana celular, pero las proteínas asociadas a la envoltura viral son codificadas por el virus. Existen varios tipos de proteínas virales asociadas a la envoltura, con al menos, cuatro actividades cruciales: unión al receptor, fusión de membranas, destrucción del receptor y proteínas que participan en la pérdida de la envoltura viral.

Las Glicoproteínas, normalmente bajo la forma de dímeros o trímeros, se ensamblan en los Peplómeros (peplos = envoltura) o Espículas del virión, como se ha observado en la superficie de los orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus, filovirus, coronavirus, bunyavirus, arenavirus y retrovirus, mediante microfotografías electrónicas (Figura 11).

Proteínas de la Matriz

Peplómeros

Bicapa lipídica

Dominio Transmembrana

Dominio Externo Hidrofílico

Hemaglutinina

Neuraminidasa



Figura 11. Estructura del virión del virus Influenza A. Todos los virus que afectan a los animales con nucleocápside helicoidal y algunos de los virus que poseen una cápside icosahédrica son envueltos. Las nucleocapsides con simetría helicoidal son largas y delgadas y en el virus Influenza A se presenta en 8 segmentos, los cuales pueden estar débilmente conectados. El ARN viral se enrolla helicoidalmente dentro de los capsómeros dispuestos helicoidalmente, como se observa en la Figura 9 para el virus del mosaico del tabaco.

Las Proteínas de Fusión son glicosiladas y también están asociadas a los peplómeros. Estas proteínas están involucradas en los pasos claves del ingreso del virión a la célula y su liberación dentro de la misma.

Las Proteínas de la Matriz son no glicosiladas y se encuentran dispuestas en capa dentro de la envoltura de orthomyxovirus, paramyxovirus, rhabdovirus, filovirus y retrovirus; pero no se encuentran en coronavirus, bunyavirus y arenavirus (Figura 11). Las proteínas de la matriz proveen una mayor rigidez al virión; por ejemplo la nucleocápside de los rhabdovirus está adosada a una rígida capa de proteína de matriz, la cual a su vez está estrechamente unida a la envoltura viral y al dominio interno de la superficie glicoproteica de los peplómeros.

Relación entre la estructura y la función del virión

Las cápsides o las envolturas de los virus no son simplemente embalajes. Ellas pueden ser lo suficientemente estables al ambiente como para proteger al ácido nucleico contenido en el virión; además, pueden encontrarse en un “estadio primario” que facilita la incorporación del virión a las células blanco y su posterior infección. Este “estadio primario” normalmente involucra reordenamientos conformacionales en las estructuras de la superficie del virión en respuesta a varios estímulos. Por ejemplo, durante el ingreso al huésped, la proteína hemaglutinina de los virus Influenza es atacada por enzimas extracelulares, generando una estructura primaria modificada. Durante el ingreso a la célula hospedadora, a través del proceso de endocitosis, la hemaglutinina primaria se activa al exponerse a un pH bajo dentro del endosoma. Esta hemaglutinina activada es la que interviene en el daño a la membrana del endosoma, para que de este modo se libere el ARN viral en el citoplasma de la célula.

A partir de este ejemplo, queda claro que el conocimiento detallado de las estructuras del virión puede explicar muchos aspectos prácticos:

(1) Los mecanismos de unión, penetración y pérdida de la envoltura viral como objetivos en el diseño de drogas antivirales;

(2) Los mecanismos del ensamblaje del virión como objetivo para el uso y diseño de las drogas antivirales;

(3) Las bases de la integridad del virión como el objetivo de drogas desinfectantes;

(4) Los mecanismos de diseminación y los patrones de transmisión viral como objetivos del desarrollo de vacunas.

De esta manera el conocimiento de la estructura del virión contribuye al desarrollo de estrategias de control y prevención de las enfermedades virales.

Las relaciones estructura/función del virión más importantes son aquellas involucradas con la adhesión del virión a la célula hospedadora y su entrada dentro de la misma. En este contexto, los términos receptor y ligando han sido frecuentemente utilizados de un modo impreciso. De ahora en adelante, utilizaremos el termino receptor para designar a una estructura/s o molécula/s específica/s sobre la superficie de la célula hospedadora, involucrada en la adhesión o unión del virus a dicha célula. El término ligando será utilizado para la/s molécula/s sobre la superficie del virus que se unen a los receptores presentes en las células hospedadoras. Por ejemplo, la hemaglutinina del virus Influenza es el ligando que se une al receptor ubicado sobre la superficie de la célula hospedadora (Figura 12).

Bicapa lipídica

HEMAGLUTININA

Neuraminidasa

Receptor en la célula hospedadora
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Figura 12. Hemaglutinina del virus Influenza (ligando) se une al receptor ubicado sobre la superficie de la célula hospedadora.

Composición química de los viriones

Los virus se distinguen de otras formas de vida por su simple composición química. Esta composición química incluye:

1) Genoma, conformado por una o unas pocas moléculas de ARN o ADN.

2) Proteínas que forman el virión: como las proteínas estructurales, que incluyen las proteínas de la cápside y las proteínas de la envoltura viral, tales como las glucoproteínas, proteínas de fusión y proteínas de la matriz.

3) Proteínas necesarias para el ensamble del virión, denominadas proteínas no estructurales.

4) Proteínas que facilitan el comando del virus sobre la maquinaria de la célula hospedadora. Tales proteínas son enzimas involucradas en la replicación viral como replicasas, polimerasas, transcriptasas, etc.

Algunos virus simples, como el virus satélite de la Necrosis del Tabaco (un virus defectuoso que necesita del virus Herpes para ejercer algunas de sus funciones) dirigen la síntesis de sólo una proteína. La mayoría de los virus más importantes dirigen la síntesis de 5 a 10 proteínas, mientras que los grandes virus, como los poxvirus o los herpesvirus, dirigen la síntesis de más de 200 proteínas. Esta cantidad de proteínas son muy escasas en comparación con las proteínas involucradas en el proceso vital de las bacterias (más de 5000 proteínas) y de las células eucariotas (más de 100.000 proteínas).

Los virus exhiben una notable variedad de estrategias para la expresión de sus genes y para la replicación de sus genomas. El conocimiento de estos esquemas estratégicos tiene mucha importancia práctica, especialmente en el entendimiento de la infección y la patogénesis de la enfermedad y en la aplicación de medidas racionales de control y prevención de las enfermedades virales. La mayoría de los virus descubiertos recientemente tienen un rango muy limitado de huéspedes y tropismos tisulares (por ejemplo, el virus de la Inmunodeficiencia Felina). Debido a que cada vez más virus son descubiertos, se espera encontrar nuevas estrategias adicionales de replicación y expresión del genoma viral, cada una de las cuales requerirá de nuevas investigaciones.



Ácidos nucleicos virales

Los genes virales son codificados a partir del genoma compuesto por ADN o ARN viral. El ADN y ARN genómico pueden ser de cadena simple o de cadena doble. Además, el genoma de los virus puede clasificarse como monopartito, donde todos los genes virales están contenidos en una sola molécula de ácido nucleico o multipartito (o segmentado), donde los genes virales están distribuídos en múltiples moléculas o segmentos del ácido nucleico. Por ejemplo, entre los virus ARN, sólo los miembros de las familias Birnaviridae y Reoviridae tienen un genoma de ARN de doble cadena y estos genomas se encuentran segmentados: los miembros de la familia Reoviridae poseen entre 10 y 12 segmentos, dependiendo del género viral; mientras que los miembros de la familia Birnaviridae poseen sólo 2 segmentos en su genoma.

Todos los genomas virales son haploides, es decir, contienen una sola copia de cada gen; salvo el genoma de los retrovirus que es diploide.

Estas características, y otras, han sido utilizadas para ordenar la clasificación de las familias de virus que son patógenos para los animales (y humanos) presentados en la Tabla 2.



Tabla 2. Familias de virus patógenos para los animales y el hombre.


Virus ADN

ADN de doble cadena

Poxviridae

Asfarviridae

Iridoviridae

Herpesviridae

Adenoviridae

Papovaviridae

ADN de cadena simple

Parvoviridae

Circoviridae

Virus ARN

ARN de doble cadena

Reoviridae

Birnaviridae

ARN de cadena simple

  • Sentido negativo

  • No-segmentado.

Orden (Mononegavirales)

Paramyxoviridae

Rhabdoviridae

Filoviridae

Bornaviridae

  • Segmentado

Orthomyxoviridae

Bunyaviridaea

Arenaviridaea

  • Sentido positivo

  • Transcripción grupal anidada.

Orden Nidovirales

Coronaviridae

Arteriviridae

  • Transcripción directa.

Picornaviridae

Caliciviridae

Astroviridae

Togaviridae

Flaviviridae

Virus ADN o ARN con transcripción reversa.

ADN de doble o simple cadena

Hepadnaviridae

ARN de cadena simple

Retroviridae



ª Algunos virus miembros de la familia Bunyaviridae y todos los miembros de la familia Arenaviridae tienen genomas ambisentido (sentido negativo y positivo).

La notable variación en la clasificación de los virus es reflejo de los diversos mecanismos mediante los cuales la información codificada en el genoma viral es transcripta a ARN, luego traducida a proteínas y los diversos mecanismos utilizados para la replicación del acido nucleico viral.

Cuando se extrae cuidadosamente el ácido nucleico de virus ADN o ARN de ciertas familias y se introduce experimentalmente dentro de una célula, el ácido nucleico por sí mismo puede iniciar un ciclo completo de replicación viral, con la producción normal de una progenie de virus. Por esto, se dice que el acido nucleico viral es infeccioso por sí mismo.

ADN genómico viral

El genoma de todos los virus ADN que afectan a los vertebrados es del tipo monopartito, constituido por una molécula simple de ADN, la cual se dispone como una doble cadena, a excepción de los parvovirus y los circovirus (Figura 13). El genoma ADN puede ser lineal o circular, dependiendo de la familia de virus. El ADN de los papovavirus, hepadnavirus y circovirus es circular (Figura 13). El ADN circular de los hepadnavirus es parcialmente una cadena simple y parcialmente una cadena doble. El ADN circular de los papovavirus es súper-enrollado.



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Figura 13. Genoma ADN circular de 1,7 a 2,2 kb de tamaño perteneciente a miembros de la familia viral Circoviridae (arriba) y genoma ADN lineal de cadena simple, de 4 a 6 kb de tamaño perteneciente a miembros de la familia viral Parvoviridae.

La mayoría de los ADN virales del tipo lineal, presentan como característica que son capaces de adoptar una configuración circular, la que se requiere para la replicación. Las dos cadenas de ADN de los poxvirus están covalentemente unidas en su terminación, formando los denominados “extremos en horquilla” (Figura 14), de manera tal que durante la desnaturalización del virus, la molécula se transforma en ADN de cadena simple, circular y de gran tamaño.



Proteína terminal

ADN de doble cadena covalentemente unido por una proteína terminal. ADENOVIRUS

ADN de doble cadena covalentemente sellado en los extremos (“extremos en horquilla”).

POXVIRUS

Resistencia a nucleasas

ADN de doble cadena con secuencias de nucleótidos (A = adenina) repetitivas e invertidas en sus extremos

ADENOVIRUS

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Figura 14. Disposición del ADN de doble cadena. Las dos cadenas de ADN de los Poxvirus están covalentemente unidas en su terminación, formando los denominados “extremos en horquilla”. El ADN de algunos Adenovirus posee repeticiones de nucleótidos invertidas en sus extremos. El ADN de algunos Adenovirus también posee una proteína terminal, la cual se une covalentemente a los extremos 5’ del ácido nucleico.

La doble cadena lineal de ADN de varios virus del tipo ADN (y el ARN lineal, de cadena simple de los retrovirus) contienen secuencias repetitivas en sus extremos que permite la circularización del ácido nucleico. El ADN de los Adenovirus posee repeticiones de nucleótidos invertidas en sus extremos; ésta también es una característica de los Parvovirus que poseen ADN de cadena simple. Otro tipo de estructura terminal se presenta en los adenovirus, hepadnavirus, parvovirus y algunos virus ARN de cadena simple, tales como los picornavirus y los calicivirus. En estos virus, una proteína terminal, la cual tiene una función esencial en la replicación del genoma, se une covalentemente a los extremos 5’ del ácido nucleico (Figura 14).

El tamaño de los genomas ADN virales varían desde los 1,7 kpb de algunos circovirus a más de 200 kpb para el ADN de doble cadena de los grandes poxvirus y herpesvirus. Debido a que 1 kpb de ADN de doble cadena contiene suficiente información genética para codificar una proteína de tamaño promedio, podría suponerse que los ADN virales contienen aproximadamente entre 2 a 200 genes que codifican para 2 a 200 proteínas. Sin embargo, la relación entre una secuencia de nucleótidos en particular y la proteína generada por ella no es tan sencilla ni directa. Por un lado, el ADN de la mayoría de los grandes virus, como los que afectan a las células de los mamíferos, contiene lo que aparenta ser información redundante bajo la forma de secuencias de nucleótidos repetitivas, de manera que la capacidad codificante de los grandes virus podría ser sobreestimada. Por otro lado, la capacidad codificante podría ser subestimada:

1) una determinada secuencia de ADN o ARNm puede ser leída en uno a tres marcos de lectura diferentes, resultando en una a tres proteínas con diferentes secuencias de aminoácidos.

2) pueden transcribirse una o ambas hebras de la doble cadena de ADN y en cualquier dirección, cada una produciendo proteínas diferentes.

3) los genes pueden solaparse, produciendo varios transcriptos y productos proteicos.

4) un transcripto simple de ARN puede ser cortado o modificado de diferentes maneras para producir varios tipos característicos de ARNm, cada uno de los cuales pueden ser traducidos en diferentes proteínas.

El ADN viral contiene varios tipos de secuencias no codificantes, algunas de las cuales se han conservado a través de la evolución, debido a que ellas codifican funciones virales, tales como: sitios de iniciación de la replicación de ADN, sitios de reconocimiento de la ARN polimerasa, sitios de inicio y terminación de la traducción, sitios de corte del ARN, promotores, potenciadores, etc.



ARN genómico viral

Con excepción de los reovirus y birnavirus, todos los genomas ARN de los virus que afectan a los vertebrados son moléculas de ARN de cadena simple. Pueden ser monopartitos o multipartitos: por ejemplo, los retrovirus, paramyxovirus, rhabdovirus, filovirus, coronavirus, arterivirus, picornavirus, togavirus y flavivirus tienen genomas monopartitios; mientras que los orthomyxovirus, bunyavirus y arenavirus tienen genomas multipartitos. Los genomas de los arenavirus poseen 2 segmentos, los bunyavirus 3, los orthomyxovirus poseen 6, 7 u 8 segmentos (dependiendo del género), birnavirus 2 y los reovirus poseen 10, 11 u 12 segmentos (dependiendo del género). Cada molécula de ARN en estos virus es única (frecuentemente codifica para una única proteína). Con excepción de la pequeña cadena simple y circular del ARN del virus delta de la hepatitis, ningún genoma de los virus ARN que afectan a los animales están covalentemente unido en forma circular. Sin embargo, el ARN de cadena sencilla de los bunyavirus y arenavirus aparenta ser “circular”, debido a los extremos de unión a hidrogeno del tipo “pegajoso”. Los genomas de los virus ARN de cadena sencilla tienen una estructura secundaria considerable, es decir, regiones de apareamiento de las bases nucleotídicas, que causan la formación de “bucles”, “rulos”, etc. (Figura 15); los cuales sirven probablemente como señales de regulación de la replicación, transcripción y traducción del ácido nucleico y/o empaquetamiento de la cápside.




Cadena simple

Cadena doble

Prominencia nucleotídica simple

Prominencia nucleotídica triple

Rulo o bucle

Rulo interno simétrico

Rulo interno asimétrico

Agrupación axial

Unión de tres cadenas

Unión de cuatro cadenas


Figura 15. Estructuras secundarias en la disposición de la molécula de ARN. Las estructuras secundarias se definen como regiones de apareamiento de las bases nucleotídicas en la hebra de ARN, que causan la formación de “bucles”, “rulos”, etc. Los genomas de los virus ARN de cadena sencilla tienen una estructura secundaria considerable.

El ARN genómico de cadena simple puede ser definido de acuerdo a su “sentido” (también conocido como “polaridad”). Si el ARN genómico tiene el mismo sentido que el ARNm, es decir, puede dirigir directamente la síntesis de una proteína, recibe del nombre de “ARN genómico de sentido positivo” (Figura 16). Este es el caso de los picornavirus, calicivirus, togavirus, flavivirus, coronavirus y retrovirus. Por otro lado, si la secuencia de nucleótidos del ARN genómico es complementaria a la secuencia del ARNm, recibe el nombre de “ARN genómico de sentido negativo” (Figura 16). Tal es el caso de los paramyxovirus, rhabdovirus, filovirus, orthomyxovirus, arenavirus y bunyavirus, quienes poseen una ARN polimerasa dependiente de ARN (o transcriptasa) en el virión. En las células infectadas, esta enzima transcribe el ARN de sentido positivo utilizando el genoma viral como cadena molde. En los arenavirus y en al menos un género de los bunyavirus, uno de los segmentos del ARN es ambisentido, es decir tiene una parte del genoma con sentido positivo y la otra parte con sentido negativo. Cuando el ARN viral es de sentido positivo, tiene normalmente poliadenilado su extremo 3’ (picornavirus, calicivirus, togavirus y coronavirus, pero no los flavivirus) y encapuchado su extremo 5’ (togavirus, flavivirus y coronavirus).




PROTEINAS

ARNm de sentido positivo

ARN genómico viral de sentido negativo

TRANSCRIPTASA


Figura 16. Virus con ARN genómico de sentido negativo. Si la secuencia de nucleótidos del ARN genómico es complementaria a la secuencia del ARNm, recibe el nombre de “ARN genómico de sentido negativo”. Estos virus poseen una ARN polimerasa dependiente de ARN (o transcriptasa) en el virión que transforma al ARN genómico de sentido negativo en ARNm de sentido positivo.

El tamaño de los genomas ARN virales de cadena simple varía entre 1,7 a 21 kpb y aquellos genomas ARN virales de doble cadena varía entre 18 a 27 kpb, un rango de variación mucho menor al encontrado para el tamaño del ADN genómico de doble cadena. En consecuencia, estos virus codifican menos proteínas que la mayoría de los virus ADN, generalmente menos de una docena de proteinas. La mayoría de los segmentos de los genomas de los orthomyxovirus y reovirus son genes individuales, cada uno de los cuales codifican para una única proteína.



Proteínas virales

Los viriones de la mayoría de los virus que afectan a los vertebrados contienen diferentes tipos de proteínas, el número varía desde 1 proteína en los virus más simples a más de 100 proteínas en los virus más complejos. Algunas de las proteínas codificadas por los virus son:



Proteínas estructurales: proteínas utilizadas para la construcción de la cápside y otros componentes del virión.

Proteínas no estructurales: estas proteínas no son parte de la estructura del virión maduro, pero están involucradas en el ensamblaje del virión o en varios aspectos del proceso de replicación viral. La mayoría de estas proteínas son enzimas, las que están involucradas en la replicación, transcripción y traducción del ácido nucleico, en la inhibición de las funciones de las células hospedadoras y en la toma de mando de la maquinaria celular para permitir las actividades de síntesis viral. Estas proteínas incluyen varios tipos de:

1) Replicasas (replicasas de ADN dependientes de ADN) y otras enzimas involucradas en la replicación del ADN viral.

2) Transcriptasas, que transcriben ARNm a partir de ADN genómico viral de doble cadena, ARN genómico viral de doble cadena o ARN genómico viral de cadena simple sentido negativo.

3) Varias proteasas, helicasas y ligasas.

4) Transcriptasa inversa, que transcribe ADN a partir del ARN. Esta enzima sólo se encuentra en retrovirus y hepadnavirus.

5) Enzima exclusiva de los retrovirus. Otra enzima que se sólo encuentra en los retrovirus, está involucrada en la integración del ADN (producido por la transcriptasa inversa) con el ADN cromosomal de la célula infectada.

6) Enzimas exclusivas de los poxvirus. Los poxvirus, que replican en el citoplasma de la célula hospedadora, tienen poco acceso a la maquinaria celular. Por lo tanto, necesitan de un número de enzimas únicas para el procesamiento de los ARN transcriptos y para la replicación de su ADN.

Glicoproteínas virales

La mayoría de las glicoproteínas virales se presentan como peplómeros (espículas) anclados a la membrana de la envoltura viral de los virus envueltos (Figura 11). Los viriones de algunos de los virus más complejos también contienen proteínas glicosiladas internas o externas en la cápside. Las cadenas laterales de oligosacáridos (glicanos) están unidas por enlances N-glicosídicos o, menos frecuentemente, por enlaces O-glicosídicos. Debido a que estas cadenas laterales son sintetizadas por glicosil transferasas de la célula hospedadora, la composición de carbohidratos de estos glicanos corresponden a los de las glicoproteínas de la membrana de la célula hospedadora.



Lípidos de la Envoltura Viral

La mayoría de los lípidos encontrados en los virus envueltos se presentan como una típica bicapa lipídica (Figura 11 y 12), en la cual están insertos los peplómeros (espículas) glicoproteícos codificados por el virus. En consecuencia, la composición de lípidos de la envoltura de un virus en particular depende de la composición de los lípidos de la membrana de la célula hospedadora infectada por ese virus. La composición de los lípidos de membrana de los virus también varía según el sistema de membranas utilizado para la gemación del virión (Figura 17). Por ejemplo, los lípidos de los paramyxovirus que geman a través de la membrana plasmática de la célula hospedadora difieren de los lípidos encontrados en los bunyavirus o coronavirus, los cuales geman a través de la membrana de las organelas intracitoplasmáticas. Los lípidos constituyen cerca del 25-30% del peso seco de la mayoría de los virus envueltos y el 50-60% de los lípidos de la envoltura viral son fosfolípidos y el 40-50% restante están formados por colesterol.



1) La cápside del virus se asocia con los glicoproteínas de la membrana citoplasmática de la célula hospedadora, previo a la salida del virión de dicha célula.

2) El virus protruye a través de la membrana citoplasmática, arrastrando parte de esa membrana. Este proceso se conoce como GEMACION VIRAL.

3) El virus se recubre de una envoltura formada principalmente por los fosfolípidos de la membrana de la célula hospedadora infectada.
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Figura 17. Proceso de gemación del virus a través de las membranas celulares. La composición de lípidos de la envoltura de un virus en particular depende de la composición de los lípidos de la membrana de la célula hospedadora infectada por ese virus

ESTABILIDAD DE LA INFECTIVIDAD VIRAL

En general, los virus son más sensibles que las bacterias o los hongos a la inactivación por agentes físicos y químicos, pero hay importantes excepciones. Por lo tanto, el conocimiento de la sensibilidad viral específica a las condiciones ambientales es importante para garantizar la preservación de la infectividad de los virus en las muestras clínicas recolectadas para el diagnóstico, así como también para asegurar la inactivación del virus mediante la esterilización y la desinfección o con fines prácticos como la producción de vacunas inactivadas.



Temperatura

La principal condición ambiental que puede afectar adversamente la infectividad de los virus es la temperatura. Las proteínas de la superficie son desnaturalizadas dentro de los primeros minutos a temperaturas entre 55 a 60ºC, por lo que el virión ya no es capaz de unirse ni penetrar en las células. A temperatura ambiente, la pérdida de la infectividad es más lenta pero significativa, especialmente en verano o en las áreas tropicales. Para preservar la infectividad de un virus, las muestras o los preparados que contengan virus deberían ser almacenadas a una baja temperatura. Los 4 ºC logrados por exposición de la muestra al hielo o al colocarla en un refrigerador, son suficientes para asegurar la infectividad durante algunos días. Pero para garantizar un mayor tiempo de infectividad, las muestras deberían someterse a temperaturas más bajas. Son convenientes para este fin dos temperaturas:



  • -70ºC, logrados por exposición de la muestra al hielo seco (CO2 sólido) o mediante el uso de algunos freezer mecánicos.

  • -196ºC, logrados por exposición de la muestra al nitrógeno líquido.

Como regla de oro, la vida media de un virus puede ser medida en segundos a 60ºC, en minutos a 37ºC, en horas a 20ºC, en días a 4ºC y en años a -70ºC o menos.

Los virus envueltos son más lábiles al calor que los virus desnudos. Los viriones envueltos, por ejemplo, los pertenecientes al género Pneumovirus de la familia Paramyxoviridae, son susceptibles al congelamiento y descongelamiento repetitivo, probablemente como resultado de la ruptura del virión por los cristales de hielo formados por este procedimiento. Esto genera problemas durante la recolección y el transporte de las muestras clínicas. La forma más práctica de solucionar este problema es transportar las muestras envueltas con pack gel frío al laboratorio tan rápidamente como sea posible.

En el laboratorio, es muchas veces necesario preservar cepas virales durante años. Esto se logra de dos maneras:

1) mediante el congelamiento rápido de pequeñas alícuotas del virus, suspendido en un medio que contenga una proteína protectiva y/o dimetil sulfóxido, seguido de su almacenamiento a -70ºC o -196ºC.

2) mediante liofilización, es decir, deshidratación de la suspensión viral congelada bajo vacío, seguido del almacenamiento del polvo resultante a 4ºC o -20ºC. El liofilización prolonga la viabilidad del virus significativamente, incluso a temperatura ambiente y es utilizada universalmente en la fabricación de vacunas atenuadas.

Ambiente iónico y pH

Los virus se preservan mejor en un ambiente isotónico y a pH fisiológico, aunque algunos virus toleran un amplio rango de pH y de iones. Por ejemplo, mientras que la mayoría de los virus envueltos se inactivan frente a un pH 5 – 6, los rotavirus y muchos picornavirus sobreviven al pH ácido del estómago.



Solventes lípidicos y detergentes

Debido a que la infectividad de los virus envueltos se destruye rápidamente con los solventes lipídicos tales como el éter o el cloroformo o con detergentes como el deoxicolato de sodio, estos agentes deben ser evitados en los procedimientos de los laboratorios dedicados al mantenimiento de la viabilidad de los virus. Sin embargo, los detergentes son utilizados comúnmente por los virólogos para solubilizar las envolturas virales y liberar las proteínas virales utilizadas como vacunas o como reactivos químicos.



BIBLIOGRAFÍA:

  • Murphy FA, Gibbs EP, Horzinek MC, Studdert MJ. (1999). Veterinary Virology. Third Edition, Elsevier Ed., U.S.A. Traducción realizada por el Dr. Cs. Vet. Diego Grilli (Julio 2013).




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