Escuela superior politecnica del litoral facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la



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Deterioro de los embutidos

La alteración de los alimentos consiste en todos aquellos cambios de origen biótico o abiótico que hacen que el alimento no sea adecuado para el consumo.


El deterioro causado por microorganismos es resultado de las relaciones ecológicas entre el alimento y el microorganismo. Para poder predecirlo y controlarlo hay que conocer las características del alimento como medio soporte del crecimiento de microorganismos y los microorganismos que colonizan habitualmente dicho alimento.

En el caso de embutidos, cada uno de los componentes puede proporcionar microorganismos alterantes. En general estos productos se deterioran más por bacterias y levaduras que por hongos.

El deterioro de estos productos puede producirse de tres formas distintas: Producción de Limo, Agriado y Cambio de Color. La formación de limo tiene lugar en la superficie y se debe predominantemente a las bacterias lácticas; el agriado ocurre bajo la superficie y es consecuencia de la actividad de las bacterias lácticas sobre productos que contengan lactosa.


El enverdecimiento producido por peróxidos es debido a bacterias lácticas, y el producto verde no es peligroso desde el punto de vista toxicológico. El enverdecimiento debido a acido sulfhídrico se produce por una reacción con la hemoglobina causada por Pseudomonas o algunas bacterias lácticas (12).



CAPITULO 2


  1. MATERIALES Y METODOS


    1. Diseño del Experimento

Para el estudio higiénico sanitario de los embutidos tipo salchichas, es necesario realizar un diseño experimental que facilite la ejecución del mismo. El diseño de experimentos consiste en la determinación de:



  • Las variables que puedan intervenir en el estudio.

  • El número de corridas experimentales que se van a realizar

  • Los métodos que se van a utilizar.

  • Los materiales necesarios.

Todo esto nos ayudará a planificar el experimento con el fin de obtener la cantidad exacta de muestras a analizar.


      1. Estudio de población y recolección de datos

La ciudad de Guayaquil se la dividió en 3 zonas: Norte, Sur y Centro, de los cuales se seleccionaron las de mayor concurrencia de personas a dichos establecimientos que fueron los siguientes: Exclusas, Pedro Pablo Gómez, Central y Sauces 9.





FIGURA 2.1 MAPA DE LAS REGIONES DE MUESTREO, (ZONA CIRCULADA)

Se encontraron 7 diferentes marcas de las cuales son tres las que predominan porque son las de mayor consumo masivo y las vamos a nombrar de esta manera p, e y c en el figura 2.2.





Fuente: Ma. Fernanda Alzamora R. (2006)

FIGURA 2.2 VARIEDAD DE SALCHICHAS EN LOS DISTINTOS MERCADOS DE GUAYAQUIL.

La recolección de datos se lo hizo mediante un diseño de experimentos para poder determinar la cantidad de muestra y para eso hay que determinar las variables que son temperatura y carga microbiana presentes en las salchichas.

Se realizo el experimento tomando en consideración la temperatura de los establecimientos y tres microorganismos para cada una de ellas.

Cada corrida experimental consiste en mantener la temperatura constante y realizar la cuantificación de los microorganismos en las salchichas en dos o tres diluciones diferentes.



TABLA 3

NIVELES ASIGNADOS PARA CADA FACTOR DEL ESTUDIO

HIGIENICO SANITARIO DE LOS EMBUTIDOS TIPO SALCHICHA


 

FACTORES

 

 

TEMP

MICROORGANISMOS ( Dilución)

 

°C

COLIFORMES TOTALES

E COLI

SALMONELLA

STAFILOCOCCUS AUREUS

NIVELES

22

10-1 10-2

10-1 10-2

10-1 10-2

10-1 10-2

23

10-2 10-3 10-4

10-2 10-3 10-4

10-1 10-2

10-2 10-3 10-4

Fuente: Ma. Fernanda Alzamora R. (2006)

Debido a que son 12 corridas experimentales, se trabajo con 12 muestras diferentes. Cada una de las determinaciones se realiza por triplicado. El número de determinaciones será:

C* N * T * D

C: Número de corridas

N: Numero de niveles

T: Determinación por triplicado

D: Numero de Diluciones de cada muestra

12 * 3 * 3 * 2 = 216

Es decir que se realizaron 216 determinaciones en el laboratorio de microbiología para lograr este estudio (1).



      1. Toma de muestras

Las salchichas analizadas se encontraban listas para ser compradas y se tomaron dos muestras por cada establecimiento según como se planifico el muestreo mediante el diseño de experimentos. Este periodo fue los meses (Marzo y Abril). El horario de recolección de las salchichas, fue entre las 09:00 a.m. a 11:00 a.m. por ser éste el de mayor afluencia de los consumidores. La cantidad de alimento recolectado fue de aproximadamente 450 g por cada salchicha.

Las muestras se las etiqueto adecuadamente recién tomadas y la etiqueta contenía la máxima información posible como: sitio de la muestra, día, hora y lugar en que se ha realizado la toma de muestras, asegurándose que no se desprenda durante la manipulación y transporte de la muestra (3).

Para evitar alguna transformación significativa de los parámetros de prueba que fueron objeto de la investigación, las muestras se colocaron por separado en bolsas plásticas estériles selladas (Whirlpak®) debidamente identificadas y se transportaron al laboratorio de microbiología en neveras portátiles con “cold packs” para mantener la temperatura a 41°F o menos (≤ 5°C).





      1. Monitoreo de Temperaturas

Se tomó la temperatura a los alimentos en el momento de la visita. El termómetro utilizado fue de tipo bimetálico. Para evitar contaminación cruzada durante la toma de la muestra y entre muestras, el termómetro se desinfectó con alcohol (9).




      1. Preparación de las muestras

Las muestras fueron procesadas en un periodo menor de cuatro horas después de recolectadas. La muestra se la corto en porciones con un cuchillo esterilizado. Recogiendo asépticamente por lo menos 100 g de muestra con un implemento esterilizado y se transfirió a una bolsa de plástico estéril. Se tomaron diferentes muestras de arriba al centro y de otros lugares según se considere necesario. Refrigerar, congelar o mantener a temperatura ambiente según sea el caso (2).





    1. Análisis Bacteriológico

De las muestras homogenizadas se tomó 1 g y se colocaron en bolsas “stomacher” a las que se les añadió 9 ml de Agua de Peptona para hacer la primera dilución (10־¹).

Luego, se hicieron diluciones seriadas en tubos de dilución que contenían 9 ml del agua peptona. De la primera dilución se transfirieron 1 ml a uno de los tubos para obtener una dilución 10־² y así sucesivamente la dilución anterior a otro tubo de 9 ml de diluyente hasta llegar a la dilución 10-4. La enumeración de las bacterias se llevó a cabo según el método utilizado por el Bacteriological analytical manual (2). El aislamiento y la identificación de las bacterias se realizaron empleando métodos rápidos, aprobados por la AOAC como métodos alternos.



      1. Determinación de Coliformes totales y Escherichia coli.

El conteo de coliformes totales y Escherichia coli se realizó utilizando “Petrifilm” 3M los cuales contienen agar deshidratado de Bilis Rojo Violeta (VRB por sus siglas en inglés), un agente de gelificación soluble en agua fría, un indicador de glucuronidasa para identificar E. Coli, y un indicador del tetrazolio para facilitar la visualización de otras bacterias coliformes gram negativas (no E. Coli).

De cada una de las diluciones seriadas (10-1 – 10-4) se vertió 1 ml de muestra sobre las láminas por triplicado y se colocó en el centro de la lámina inferior. Se distribuyó la muestra uniformemente colocando el disco de dispersión (lado no plano) con una presión ligeramente hacia abajo desde el centro y se dejó hasta que el medio se solidificó (Apéndice A). Estas láminas se incubaron a ±35 °C (±95°F) por 24±2 horas. Luego de este periodo de incubación utilizando un contador de colonias se enumeró el crecimiento de bacterias. Sólo se reportaron las densidades de láminas que contenían entre 25 - 250 colonias. Aquellas colonias de color azul con presencia de gas se tomaron como indicativo de presencia de E. Coli.

Otras colonias de coliformes de color rojo y con presencia de gas también se tuvieron en cuenta, por lo tanto, el conteo de coliformes totales consistió en la sumatoria de las colonias rojas y azules con presencia de gas en ±24 horas, según el método aprobado por la AOAC para el conteo de este medio (Figura 2.3).



FIGURA 2.3 MUESTRA CON COLIFORMES TOTALES Y E. COLI EN PETRIFILMS


      1. Determinación de Staphylococcus Aureus

El conteo de Staphylococcus aureus se realizó utilizando “Petrifilm” 3M que tiene un sistema de medio de cultivo listo para las muestras que contiene un agente gelificante soluble en agua fría. El medio modificado cromogénico Baird-Parker en la placa es selectivo y diferencial para el Staphylococcus aureus.

De cada una de las diluciones seriadas (10-1 – 10-4) se vertió 1 ml de muestra sobre las láminas por triplicado y se colocó en el centro de la lámina inferior. Se distribuyó la muestra uniformemente colocando el disco de dispersión (lado no plano) con una presión ligeramente hacia abajo desde el centro y se dejó hasta que el medio se solidificó (Apéndice B). Estas láminas se incubaron a ±35 °C (±95°F) por 24±2 horas. Luego de este periodo de incubación utilizando un contador de colonias se enumeró el crecimiento de bacterias. Sólo se reportaron las densidades de láminas que contenían entre 25 - 250 colonias. Cuando solamente se aprecian colonias rojo-violetas, se toma como indicativo de presencias de Staphylococcus aureus.

Si se encuentra carga en el fondo de su prueba de Staphylococcus, el Disco Staph Express Petrifilm se puede utilizar para identificar el S. aureus con respecto a todas las colonias sospechosas. El Disco Staph Express Petrifilm se debe utilizar cuando se encuentren presentes colonias diferentes de rojo-violeta; por ejemplo, cuando en la placa se vean colonias negras o azul verdosas.


El Disco Staph Express Petrifilm contiene una tintura y un acido desoxirribonucleico (DNA). El S. aureus produce desoxirribonucleasa (DNasa) y la Dnasa reacciona con la tintura para formar zonas rosadas. Cuando el disco se inserta en la placa, el S. aureus (y ocasionalmente el Staphylococcus Hyicus y el Staphylococcus intermedius) producen una zona rosada. Y a estos se los conoce como Staphylococcus de coagulasa positiva, según el método aprobado por la AOAC para el conteo de este medio (Figura 2.4).





(Figura 2.3).




FIGURA 2.4 MUESTRA CON STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN

PETRIFILMS


      1. Determinación de Salmonella Microwell ELISA



ELISA: El método es similar al radioinmuno ensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido, se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una actividad marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo anticuerpo de revelado. Salmonella Microwell de ensayo es un ADN sondea - el basado diagnóstico en el formato de conjunto, que permite detección rápida y precisa de Salmonella spp. en alimentos. Los resultados son disponibles en aproximadamente 48 horas. La prueba expone el equivalente de sensibilidad al de la referencia cultural de los procedimientos y es capaz de detectar la presencia de Salmonella en una muestra de 25 g cuando los protocolos especificados de enriquecimiento se usan.

Este método es aplicable a la detección de Salmonella spp. en una variedad amplia de productos alimentarios, incluyendo la carne, aves de corral, pescado y mariscos, frutas y los vegetales, incita, nueces, enharina, productos de confitura, productos lecheros, condimentos, alimentos favoritos, y alimentos procesados diversos


El método se ha usado para detección de Salmonella. Toxinas de S aureus, micotoxinas, toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. Coli.

Reactivos

  • Pruebe fajas: microwells conteniendo anti-Salmonella anticuerpos - 96 pocillos de prueba.

  • El Control Negativo: contiene 1 ml de una base buferada.

  • El Control Positivo: contiene 1 ml de inactivo Salmonella LPS antígeno en una base buferada.

  • El Conjugado de Enzima: la botella que contiene 11 ml de un monoclonal anti-Salmonella anticuerpo conjugó a peroxidasa en un buffer con el profiláctico.

  • Cromógeno: la botella que contiene 11 ml del Cromógeno tetrametilbenzidina (TMB).

  • Lave solución de concentrado (20X): Dos las botellas que contienen 25 ml de concentrados de buffer y surfactante con el profiláctico.

  • Stop solución: la botella que contiene 11 ml de 1 M ácido fosfórico.



FIGURA 2.5 REACTIVOS DEL TEST DE MICROWELL ELISA


Materiales

  • La incubadora debe mantener temperaturas de 42° C y 37°C.

  • Microelisa lector de plato capaz de leer 450/620-650 nm (optativo).

  • Pipeta, 100ul

  • Desechable micropipeta

  • 1-2 ml tubos con casquetes que permanecerán sellados a 100°C.

  • La calefacción, el baño de agua o autoclave para 1-2 ml tubo, manteniendo 100°C.

  • Los recipientes apropiados para el almacenaje y eliminación de materiales potencialmente contaminados con agentes infecciosos

  • Los datos registran hojas

  • Solución desinfectante

Las muestras de prueba pueden ser cultivados por métodos estándares en pre - enriquecimiento y los caldos selectivos usaron para Salmonella. Típicamente, estos incluirán pre- enriquecimiento en un agua peptona buferada o el caldo nutritivo, seguido por el enriquecimiento selectivo en uno o caldos más selectivos.

Los caldos selectivos siguientes son compatibles con el SafePath Salmonella de ensayo: la selenita - cistine de caldo, Rappaport-Vassiiadis de caldo, Mueller -Kauffrnan de caldo con novobiocin. El SafePath Salmonella de ensayo es también compatible con el sistema de medios (Oxoid), que reduce tiempo total de cultivo a 24 horas.



Precaución

  • No usar soluciones si se precipitan.

  • La excepción: El concentrado de lavado puede precipitarse durante el almacenaje refrigerado pero disolverá solo calentándolo.

  • Para evitar la contaminación de pocillos, y de falsos - los positivos resultados, evitan salpicar cuando se agrega o se quita muestras o los reactivos, y lavar los pocillos completamente entre pasos.

Condiciones de almacenamiento: Los reactivos y enfrascadas componentes se almacenan entre 2 - 8° C.

La solución de lavado diluido buffer puede almacenarse a l temperatura ambiente.



Preparación de la muestra

  1. Coloco las muestras en un medio de pre-enriquecimiento (Agua de Peptona o caldo nutritivo) por métodos estándares - típicamente en volúmenes de 1 volumen de la muestra en 9 volúmenes de medio de pre-enriquecimiento (ej. 25 g en 225 mi). Para muestras líquidos con volúmenes más grandes, puede ser preferible para preparar el medio pre - enriquecimiento como 2X, 5X o 1OX concentra y agrega un volumen a la muestra que resulta en una lX de concentración de los medios (6).

  2. Incubar a 37°C por 18 a 24 horas (paso de resucitación o pre-enriquecimiento).

  3. Transferir 0.5 ml del cultivo pre-enriquecimiento a 10 ml de caldo selectivo de enriquecimiento ( Selenito-Cistine)

  4. Incubar a 42°C por 16 a 24 horas, si es posible con agitación a 120rpm

  5. Transferir 1 ml de cada cultivo selectivo a tubos limpios

  6. Calentar los tubos a 100-110°C por 10 minutos, luego enfriar a 20 o 25°C.



Procedimiento

  1. Tomar la cantidad de pocillos necesaria, recordar que deberá incluir 2 pocillos para los controles, y colocarlos en el soporte de tirillas.

  2. Adicionar 100 microlitros de el control negativo en el pocillo # 1 y 100 microlitros de el control positivo en el pocillo # 2 (Ambos ya están pre-diluidos).

  3. Adicionar 100 microlitros del sobrenadante de la muestra en los pocillos apropiados

4. Incube a la temperatura ambiente para 30 minutos, entonces lavado. *

5. Adicionar 2 gotas del Conjugado de Enzimas en todos los pocillos.

6. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos

7. Enguajar cada pocillos solo con agua destilada

8. Adicionar 1 gota de Cromógeno y una gota de substrato en todos los pocillos. Agitar suavemente golpeando el soporte de tirillas.

9. Incube a la temperatura ambiente para 5 minutos.

10. Adicionar 2 gotas de stop solution en cada pocillo. Agitar suavemente golpeando el soporte de tirillas (Apéndice C).

11. Leer los resultados visualmente, si es positivo las muestras deberán presentar un color sustancialmente amarillo pero si es negativo las muestras no tendrán un color distintivamente amarillo. El control negativo así como algunas muestras podrán presentar un ligero color amarillo (Figura 2.6).

* Cada lavado consiste de descargar los contenidos de los pocillos en un recipiente apropiado con la solución desinfectante (p. ej. 3% lejía en la agua) llenando los pocillos con la solución de lavado diluida buffer (7), sacudiendo fuera los contenidos y se lo realiza el mismo procedimiento tres veces por cada pocillo.


FIGURA 2.6 MUESTRA CON SALMONELLA EN MICROWELL

ELISA


      1. Interpretación del Análisis Microbiológico

Las muestras fueron analizadas de acuerdo con las normas ecuatorianas correspondientes, deben cumplir con los requisitos microbiológicos, establecidos en la tabla IV para muestra unitaria y a su vez se clasifica como “Aceptable” y “Rechazable”

TABLA 4
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS EN MUESTRA UNITARIA


 

REQUISITOS

 


COCIDAS

ACEPTABLE

RECHAZABLE

MAX. UFC/g

MAX. UFC/g

Coliformes totales

<3 *

>3

Escherichia coli**

<3 *

>3

Staphylococcus aureus

1.0 x 102

>1.0 x 102

Salmonella

aus/25g

pres/25g



Fuente: NTE INEN1338-1996
* Indica que el método del numero mas probable NMP (con tres tubos por dilución), no debe dar ningún positivo.
** Coliformes fecales

El propósito de esta norma es ayudar a determinar la calidad bacteriológica de las salchichas para el consumo en el sitio de venta e indicar los niveles de contaminación y si éstos representan un riesgo potencial a la salud (4).




    1. Análisis Estadístico

Se realizó un test estadístico para evaluar la asociación o independencia entre dos variables, utilizando una prueba estadística de Chi cuadrado (X2 test). Adicionalmente se comparó el monitoreo de temperatura para los diferentes mercados de la ciudad de Guayaquil y se correlacionó con la calidad microbiológica de las salchichas de los establecimientos.

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