Efecto del carbón activado y ácido indol acético en el desarrollo de protocormos de Masdevallia coccinea Linden ex Lindl y Maxillaria nutans Lindl In vitro Effect



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Efecto del carbón activado y ácido indol acético en el desarrollo de protocormos de Masdevallia coccinea Linden ex Lindl. y Maxillaria nutans Lindl.. In vitro
Effect of activated charcoal indol and acetic acid in the development of Masdevallia coccinea Linden ex Lindl y Maxillaria nutans Lindl. protocorm like bodies under in vitro
Jaime Alonso Pedroza-Manrique*

Lina Constanza Serrato-Muñoz*

Mileidy Castaño-Robayo**
Recibido: febrero 15 de 2010

Aprobado: octubre 25 de 2010

RESUMEN

En esta investigación se pretende estimular el desarrollo de protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans bajo condiciones in vitro utilizando diferentes concentraciones de ácido indol acético y carbón activado. El protocolo obtenido es una alternativa de la conservación de orquídeas que se encuentran en vías de extinción, y además permite contribuir con el mejoramiento medioambiental. En la evaluación del desarrollo vegetativo bajo condiciones in vitro de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans, orquídeas en vías de extinción, se obtuvo que solamente Maxillaria nutans alcanzará su desarrollo exitoso mediante el cultivo in vitro en el medio Murashige y Skoog (1962), donde se evaluó el efecto de la interacción entre el carbón activado (0,0; 0,5, 1,0 % (p/v)) y el ácido indol acético (0,0; 0,5; 1,0 mg/L-1). El medio de cultivo empleado fue enriquecido con sacarosa al 3% y el Myo inositol al 0,1 g/L-1. Los protocormos de Masdevallia coccinea evidenciaron que se encontraban inmaduros, situación por la cual no lograron su desarrollarlo vegetativo en el experimento planteado, en atención a que se encontraban en el periodo de latencia. Por esta razón, es de gran importancia tener en cuenta que las cápsulas de las orquídeas deben estar bien maduras, a fin de garantizar que los protocormos que se forman in vitro sean maduros y completen con facilidad su morfofisiológía. Mientras que los protocormos de Maxillaria nutans dieron un mayor rendimiento en su desarrollo vegetativo. En esta investigación se determinó que el efecto de la interacción de 0,5% de carbón activado con 0,5 mg/L-1 de AIA es positivo sobre la tasa de crecimiento para el desarrollo de los protocormos de Maxillaria nutans bajo condiciones in vitro.



Palabras clave: Masdevallia coccínea, Maxillaria nutans, in vitro, carbón activado, AIA.
Abstract

The evaluation of protocorms growth of Masdevallia coccinea and Maxillaria nutans under in vitro conditions, endangered orchids, it got only Maxillaria nutans reached its successful development by culture in vitro in Murashige and Skoog (1962), which evaluated the effect of the interaction between the activated carbon (0.0, 0.5, 1,0% (w / v)) and indole acetic acid (0.0, 0.5, 1.0 mg.L-1). The culture medium used was enriched with 3% sucrose and 0.1 g/L-1 Myo inositol. Protocorms of Masdevallia coccinea, showed that they were immature, state why they did not achieve their vegetative development in the experiment raised, considering that they were in the latency period. It is therefore very important to note that the capsules of the orchid should be ripe, to ensure that protocorms formed in vitro are mature and they respond with ease morphphysiology development. While protocorms of Maxillaria nutans, gave a higher yield in its vegetative development. This research found that the interaction effect of 0.5% activated carbon with 0.5 mg/L-1 of IAA is positive on the growth rate for the development of Maxillaria nutans protocorms under in vitro conditions. The protocol obtained in this investigation is an alternative of conservation of orchids that are endangered and can contribute to further environmental improvement.



Key words: Masdevallia coccinea, Maxillaria nutans, in vitro, activated charcoal, IAA.
Introducción

La familia Orchidaceae es una de las más abundantes del mundo, y la belleza de sus flores representa un gran potencial para la industria ornamental; aparecieron sobre la faz de la tierra hace unos 100 a 200 millones de años en el archipiélago de Borneo, y desde allí se extendieron a todos los continentes (Rivera, 1998). En los trópicos es donde se concentra el mayor número de ellas, y es precisamente en estas regiones donde se ha producido el mayor impacto ecológico provocado por el hombre en los últimos años. Las amenazas que directa o indirectamente afectan a las orquídeas son la deforestación, los incendios forestales, el trasiego ilegal de plantas, el manejo inapropiado de especies (Zambrano, 2000; Cupitra, 2009; Escudero e Iriondo, 2009; Magdaleno, 2009; Zamora, 2009).

En este trabajo se realizó el cultivo in vitro de dos especies de orquídeas: Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans, plantas terrestres humícolas endémicas de Colombia que se encuentran en vías de extinción, con la categoría global “En peligro” (EN), como consecuencia de su reducción poblacional mayor al 50% en los últimos 30 años, debido a altos niveles de recolección y a una disminución en la calidad del hábitat (Instituto Alexander von Humbolt, 1997; Okada, 2001; Calderón, 2007; Sarmiento, 2009). Estas especies son poco cultivadas ya que su crecimiento y desarrollo son lentos, por tanto, se pretende realizar cultivos en medio in vitro para acelerar su desarrollo, preservar estas especies y conservarlas. La realización del cultivo in vitro se generó a partir de la siembra de protocormos (pequeños cuerpos isométricos), en un medio nutritivo llamado Murashige & Skoog (1962), el cual le proporciona macro y micronutrientes a las semillas, desplazando las funciones del hongo en la relación simbiótica. Este medio fue enriquecido con el AIA, la hormona que desencadena el enraizamiento y la elongación de la planta, y el carbón activado que sirve de sustrato y absorbe los fenoles oxidantes en la misma.

Con esta técnica se pretende estandarizar un protocolo para el desarrollo de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans; siendo estas dos especies no cultivadas en condiciones de laboratorio, cuya multiplicación ha estado sujeta a los métodos convencionales de propagación vegetativa in vivo, el establecimiento de un protocolo encaminado al crecimiento y desarrollo de protocormos de Masdevallia y Maxillaria bajo condiciones de cultivo in vitro requiere de la evaluación de diversos factores que tanto de forma individual como integrada determinan el éxito del vitro-cultivo, dentro de estos factores se encuentran los medios de cultivo en cuanto a su composición nutritiva y reguladores del crecimiento, así como las condiciones de incubación como luz y temperatura.

La implementación de un diseño experimental mediante el cultivo in vitro pretende evaluar el efecto del carbón activado y del fitorregulador ácido indol acético (AIA), sobre la tasa de crecimiento y desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans, buscando encontrar las concentraciones óptimas en que estas sustancias se deben adicionar a los medios de cultivo para obtener un resultado favorable respecto al desarrollo de estas plantas bajo condiciones de cultivo in vitro. De igual forma, es importante tener en cuenta el estado de desarrollo de las cápsulas de orquídeas que se utilizan en estos procesos, a fin de garantizar el desarrollo morfofisiológico de los protocormos que se logran generar tan pronto las semillas de las orquídeas germinan de forma asimbióticamente bajo condiciones in vitro.

Materiales y métodos

La evaluación del efecto del AIA y del carbón activado en el desarrollo de los protocormos bajo condiciones in vitro de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans, se obtiene siguiendo los siguiendo pasos:



  1. Colección de cápsulas. El material vegetal se obtuvo mediante cápsulas de las dos especies de orquídeas colectadas en el páramo de Guasca localizado en el departamento de Cundinamarca, en la región del Guavio, a cincuenta kilómetros al nordeste de la ciudad de Bogotá D. C. Tiene una temperatura promedio de 15 ºC y se encuentra a una altitud de 2.700 metros sobre el nivel del mar, ubicándose entre los pisos térmicos frío y páramo. Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans, para el cultivo de semillas bajo condiciones in vitro, se encuentran entre los 7 y los 8 meses a partir de la polinización, para lograr obtener un mayor porcentaje de embriones viables, que se verá representado en un porcentaje de germinación alto, menor tiempo de germinación y desarrollo de los protocormos de buen vigor.

  2. Desinfección de las cápsulas. Las cápsulas fueron desinfectadas en solución de detergente comercial Axión® en polvo durante 10 min, y enseguida enjuagadas con agua destilada estéril. Posteriormente, las cápsulas se sumergieron en solución de hipoclorito de sodio al 0,5% por 10 min, y enjuagadas tres veces con agua destilada estéril, bajo condiciones asépticas en el laboratorio.

  3. Siembra de las semillas bajo condiciones in vitro. Las semillas fueron retiradas de las cápsulas y se colectaron en cajas de Petri. Luego se sembraron en los medios de cultivo MS enriquecidos con 3% de sacarosa, 0,1 g/L-1 de Myo-inositol, 10,0 g/L-1 de fécula de maíz (Maizena®) y 3,0 g/L-1 de Agar. El pH de todos los medios fue ajustado a 5,8, antes de ser esterilizados a una presión de 1,06 kg cm.-2 por 20 min.

  4. Incubación de las unidades experimentales. Los cultivos fueron incubados en luz blanca (20 µmol m-2s-1 dada por luz fluorescente) (tubos fluorescentes de luz día FL-20D/18, 20 W, China Electric Co., Taipei), a 20 ± 2 ºC hasta alcanzar pequeños protocormos redondos (2,5 mm en diámetro) con un fotoperiodo de 16 h. Las semillas de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans así germinadas alcanzan el estado de protocormo a las 24 semanas después de la siembra, momento en el cual se inicia el estudio del desarrollo de los protocormos, de acuerdo con el diseño experimental

  5. Evaluación del desarrollo de los protocormos. En esta fase del trabajo de investigación se seleccionó el material vegetal, después de los seis meses de germinación, que en ese momento se encontraba en el estado de protocormo sin desarrollo de un vástago o con un desarrollo del vástago no superior a los 2 mm de longitud. La totalidad de los tratamientos fue recultivado en medio MS donde se evaluaron los siguientes dos factores: carbón activado (0,0; 0,5; 1,0% (w/v) y ácido indol acético (0,0; 0,5; 1,0 mg/L-1) para un total de 9 tratamientos (tabla 1). La medición de la tasa de desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans bajo condiciones del cultivo in vitro se realizó evaluando la respuesta morfológica de los protocormos ante la alteración de concentraciones de ácido indol acético y carbón activado.

La medición cualitativa de la tasa de crecimiento y desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans tienen cinco niveles: nulo, bajo, medio, alto y muy alto. Para efectos del análisis estadístico, a cada uno de los niveles de valoración cualitativa se la asignará, en concordancia, un valor cuantitativo (tabla 2).

Tabla 1. Combinación de concentraciones de la auxina A.I.A y carbón activado en un diseño completamente al azar con arreglo factorial (3x3) para estimular el desarrollo de protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans


Carbón activado (%)

Ácido indol acético mg/L-1

Tratamiento

0,0

0,0

1

0,5

2

1,0

3

0,5

0,0

4

0,5

5

1,0

6

1,0

0,0

7

0,5

8

1,0

9



Tabla 2. Correspondencia cuantitativa para cada uno de los niveles de valoración cualitativa dispuestos para la medición de la tasa de crecimiento y desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans bajo condiciones de cultivo in vitro

Nivel cuantitativo

Nivel cualitativo

0

Nulo

1

Bajo

2

Medio

3

Alto

4

Muy alto


Análisis estadístico

Los protocormos fueron distribuidos de acuerdo a un diseño completamente al azar con arreglo factorial de 3 x 3. Tres concentraciones de carbón activado (0,0; 0,5; 1,0 % (p/v)) y tres concentraciones de AIA (0,0; 0,5; 1,0 mg/L-1), para un total de 9 tratamientos, cada uno con 10 réplicas, donde cada réplica estaba representada por un frasco de cultivo con 10 protocormos que evaluaron el desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans, para un total de 90 frascos. Las diferencias entre las medias fueron establecidas empleando la prueba de Tukey (Steel y Torrie, 1985) a fin de establecer el mejor tratamiento con respecto al estado de desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans. El análisis estadístico permite evidenciar el efecto interactivo entre el carbón activado y el AIA.



Resultados y discusión
El efecto del carbón activado y del ácido indol acético en el desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea y Maxillaria nutans señaló diferencias estadísticas altamente significativas (p<0,01) entre los 9 tratamientos evaluados, que a continuación son analizados.

Adaptación de protocormos de Masdevallia coccinea bajo condiciones in vitro

Los protocormos de la especie M. coccinea fueron sembrados en cada uno de los tratamientos, en los cuales no se evidenció ningún crecimiento durante las 21 semanas de adaptación, a esto se le atribuye que las semillas de orquídeas son muy pequeñas y contienen muy pocas o ninguna reserva alimenticia; debido al pequeño tamaño de las semillas no hay éxito en la germinación bajo condiciones ambientales (Flórez y Pedroza, 2006). Los protocormos de Masdevallia coccinea se encontraban inmaduros, situación por la cual no lograron su desarrollo vegetativo en el experimento donde se deseaba conocer el efecto de la interacción entre el carbón activado y el ácido indol acético. Por esta razón, es de gran importancia tener en cuenta que las cápsulas de las orquídeas deben estar bien maduras, a fin de garantizar que los protocormos que se forman in vitro serán maduros y su desarrollo fisiológico responda con facilidad tan pronto han superado el periodo de latencia (Pedroza, 2008). Ante esta situación, es importante tener en cuenta que la cápsula de la especie Masdevallia coccinea llega a dos tercios de su madurez; de hecho, cuando presentan una coloración verde-violeta las cápsulas son inmaduras, situación que restringe la germinación de sus semillas; al contrario, cuando las cápsulas presentan coloración amarilla-violeta están maduras y sus semillas se encuentran adecuadas para su germinación.



En este contexto, el cultivo bajo condiciones in vitro es una alternativa que facilita la germinación de todas las semillas de las cápsulas de las orquídeas que se encuentran bien maduras. De esta forma, la germinación in vitro permite la producción de gran número de plántulas en un corto periodo de tiempo, y se logra reducir en un 85% aproximadamente el tiempo de germinación de semillas de orquídea, que in vivo puede requerir un periodo de tiempo cercano a los 3 años (Devesa, 1997). Por esta razón, se evidenció que las cápsulas de Masdevallia coccinea no estuvieron suficientemente maduras, situación por la cual los embriones tienen muy pocas posibilidades de desarrollo vegetativo en un medio asimbiótico que necesita unas condiciones especiales diferentes a los demás medios asimbióticos. Varias investigaciones coinciden con el hecho de que los embriones inmaduros necesitan más reservas alimenticias para su posterior adaptación al medio y para lograr un adecuado desarrollo, este medio debe ser rico en sacarosa con niveles más elevados a los que se usan en otros medios basales (30% de sacarosa), incluso afirman que estos medios pueden ser enriquecidos con reguladores tipo auxina que facilitan el desarrollo de los embriones inmaduros. Además, las cápsulas deben estar en un tiempo adecuado de maduración, que no sea muy verde, porque las semillas quedan en un estado de latencia en el cual no se logra alcanzar una etapa mínima de desarrollo; es decir, difícilmente llegan a desarrollarse cuerpos protocórmicos y una diferenciación celular a partir de la cual pueda surgir un embrión bien desarrollado (Dixon, 1987; Margara, 1988; Shimasaki y Uemoto, 1991; Arditti y Ernst, 1993; Seeni y Latha, 1994; Nayak et al., 1998; Chan y Chang, 2000; Takahashi et al., 2000; Murthy y Pyati, 2001; Zettler et al., 2001; Bowles et al., 2002; Peláez, 2002; Pyati et al., 2002; Park et al., 2002; Chen et al., 2002; Martin, 2003; Chen y Chang, 2004).
Durante esta etapa inicial no se observaron cambios positivos en el desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea en los diferentes tratamientos con carbón activado y la auxina AIA (figura 1). Posteriormente, se procedió a sembrarlas en un medio nutritivo libre de hormonas y carbón activado (tratamiento 1), utilizando fécula de maíz en un porcentaje del 1% (figura 2), como aporte de nutrientes para la semilla, ya que contiene glutamina que es especialmente necesaria para el crecimiento de embriones inmaduros, puesto que es una importante fuente de nitrógeno (Pierik, 1990).
En términos generales, los protocormos de Masdevallia coccinea se conservaron en este medio durante los seis meses posteriores a la siembra, mostrando un crecimiento nulo en todas las fases de desarrollo y en todas las réplicas, tanto en crecimiento de rizoides, como en raíces y primordios foliares, como se muestra en la tabla 3.

Tabla 3. Desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea en diferentes etapas; brote apical, rizoides y plántula en desarrollo utilizando medio basal MS con fécula de maíz al 1%


Semanas

Brote apical

Rizoides

Plántula en desarrollo

2

1

0

0

4

1

0

0

6

1

1

0

8

1

1

0

10

1

0

0

12

1

0

0

Los protocormos en este medio de cultivo lograron un desarrollo muy bajo de los brotes apicales y de los rizoides, mientras que las plántulas no alcanzaron su desarrollo vegetativo. De esta forma, todos los protocormos permanecieron en un periodo de latencia, porque requieren finalizar dicho periodo y enseguida lograr su desarrollo morfofisiológico De hecho, el periodo de latencia corresponde al lapso que transcurre entre el momento de recibir el estímulo y manifestar su reacción fisiológica, porque la semilla logra reconocer las condiciones del medio que son apropiadas para el establecimiento de la plántula (Flórez y Pedroza, 2006).


En la sexta semana se detuvo el desarrollo de los protocormos de Masdevallia coccinea por el efecto del 30% de la oxidación, situación que inhibió su crecimiento. Probablemente, una de las causas para la oxidación es la temperatura, ya que los 20 ºC en la incubación es el factor ambiental de mayor importancia que regula la germinación y el crecimiento de las plántulas (Taiz y Zeiger, 1998). Arditti y Ernst (1993), señalan que para las orquídeas, el desarrollo de la germinación in vitro se prefiere en un rango entre 20 y 25 °C de temperatura, con un óptimo alrededor de los 20 °C, con el mínimo posible de variación (Ospina y Dressler, 1979).

Adaptación de protocormos de Maxillaria nutans bajo condiciones in vitro

Los protocormos de Maxillaria nutans se desarrollaron favorablemente, observándose protocormos con alta presencia de clorofila y de gran tamaño a los cuatro meses posteriores a la siembra. Estos protocormos fueron adaptados a los 9 tratamientos con presencia de carbón activado y la auxina AIA, mostrando cambios positivos en todos los tratamientos en proporciones diferentes; en general, el cuerpo protocórmico en todas las réplicas de Maxillaria nutans presentó desarrollo y crecimiento.

Los resultados obtenidos en las siembras realizadas en la primera etapa permitieron determinar que las semillas de M. nutans requieren para su germinación la adición de reguladores de crecimiento tipo auxina en baja concentración. Estas observaciones coinciden con los planteamientos de Arditti y Ernst (1993), quienes manifiestan que la mayoría de los tejidos de orquídeas requieren auxinas y citoquininas para su crecimiento, aunque algunos trabajos muestran que no todas las orquídeas requieren de estas, especialmente para los procesos de germinación, como se evidencia en los casos en los que se presentó respuesta de desarrollo protocórmico en tratamientos que no contenían ningún regulador de crecimiento, como se manifestó en el tratamiento 4 (0,5% CA y 0,0 mg/l-1 AIA), situación que coincide con los planteamientos de Montoya (1991), quien sugiere que generalmente los embriones son autónomos para la mayoría de los reguladores de crecimiento, por contener concentraciones endógenas de hormonas adecuadas para iniciar su desarrollo.

Es importante tener en cuenta que el ácido indol acético (AIA) es una auxina que se produce de forma natural en las plantas, sintetizada a partir de triptófano; se produce en los tejidos de la propia semilla, sin importarse de los tejidos de la planta madre, y su contenido aumenta en el periodo medio de la embriogénesis (Davies, 1987; Pedroza et al., 2005). Morel (1973) considera que la mayor parte de los tejidos vegetales son incapaces de desarrollarse en medios que no contienen auxinas, aunque existen plantas que en condiciones in vitro no precisan de ellas, siendo plantas autótrofas para este tipo de sustancias (Pierik, 1990).

Se pudo evidenciar que a las tres semanas de realizada la siembra de los protocormos, los tratamientos 1, 2, 3, 7 y 8 no presentaron diferencias significativas en cuanto al crecimiento del brote apical, observando valores cuantitativos (0-1) nulo-bajo, mientras que en los tratamientos 4, 5 y 6 el desarrollo fue de nivel bajo a medio (0-2) y en el tratamiento 9 no se evidenció ningún cambio (0) como se observa en la figura 3. Con respecto al tratamiento 9 se evidenció que no hubo un desarrollo morfológico porque la semilla necesita perder sustancias inhibidoras de la germinación para así iniciar su desarrollo (Jann y Amen, 1980). Los protocormos en esta etapa empiezan a adaptarse al medio asimbiótico y se evidencia desarrollo morfológico, donde se inicia la multiplicación y el crecimiento celular, y por tanto hay desarrollo apical y fisiológico, porque hay hidratación en los tejidos, absorción de oxígeno, intensificación de las actividades enzimáticas y de digestión de nutrientes (Pedroza, 2008). En general, en la tercera semana de adaptados los cuerpos protocórmicos a los diferentes tratamientos con el carbón activo y la auxina ácido indol acético no se observan diferencias altamente significativas, lo cual demuestra que los protocormos después de adaptados siguen un desarrollo normal igual para los diferentes medios con crecimiento de brote apical y presencia de clorofila, que indica que han empezado a fotosintetizar dichos protocormos en desarrollo y además están utilizando todos los materiales de reserva presentes en el medio nutritivo.

Entre las semanas 6 y 9 no se evidenciaron cambios significativos, a diferencia del tratamiento 3 que pasó de nivel bajo a medio (1-2). En el tratamiento 9 se observó un crecimiento bajo del brote apical. Estos protocormos evidencian un desarrollo lento, porque sus semillas son de tamaño pequeño y no permiten una rápida absorción de los nutrientes del medio basal y de las hormonas, como en las auxinas donde el movimiento de nutrientes es lento a través de los tejidos (Pierik, 1990; Salisbury y Ross, 2000).

De igual forma, entre las semanas 12 y 15, el tratamiento 2 se encuentra en mejor desarrollo llegando a un nivel medio (2), los tratamientos 5 y 6 comienzan a mostrar un nivel alto en el desarrollo del brote apical. En los tratamientos 5 y 6 se muestra la madurez morfológica, ya que las distintas estructuras de la semilla han completado su desarrollo y el embrión ha llegado a su máximo desarrollo. En términos generales, durante las 21 semanas los tratamientos que mostraron mayor crecimiento apical fueron los tratamientos 5 y 6, con niveles de nulo a muy alto (0-4). Los de menor desarrollo fueron los tratamientos 1, 7 y 9, los cuales se encontraron entre nulo y bajo (0-1) siendo su crecimiento muy lento y poco diferenciado (figura 4).

En general, el desarrollo de la plántula fue óptimo para los tratamientos 4, 5 y 6 con niveles de nulo-alto (0-3), teniendo un desarrollo favorable para la plántula; sin embargo, el tratamiento que mostró mejores resultados fue el tratamiento 5, con concentraciones del carbón activado al 0,5% y de la auxina AIA de 0,5 mg/l-1 (figura 5). De hecho, el carbón activado y el AIA estimulan y mejoran los procesos de desarrollo morfogenético de los protocormos y de las plántulas de diferentes orquídeas (Vij et al., 1994; Chen et al., 1999; Margara, 1998). En la semana 21 se observó un crecimiento nulo-bajo (0-1) del desarrollo de rizoides entre los tratamientos 1, 2 y 9; los tratamientos con un efecto más favorable en el desarrollo de rizoides fueron el 5 y 6, que mostraron niveles de nulo-alto (0-3) y nulo-medio (0-2), respectivamente. De esta forma, se evidencia que la interacción entre el carbón activado al 0,5% y la auxina AIA al 0,5 mg/L-1y 1,0 mg/L-1 favorecieron la inducción y el desarrollo de las raíces de los protocormos de Maxillaria nutans, de acuerdo con sus interacciones fisiológicas en el desarrollo de los protocormos (figura 6).

Asimismo, la temperatura óptima lograda para la germinación de semillas de Maxillaria nutans coincide con las estimaciones de Pierik (1990), quien sugiere que la temperatura óptima para el crecimiento y desarrollo in vitro es generalmente 20-25 °C más alta que la correspondiente para el crecimiento in vivo, aunque la temperatura en los recipientes de cultivo es 25 °C más alta que en la cámara de crecimiento, debido al efecto de la irradiación. Salisbury y Ross (2000) señalan que, a veces, una variación de pocos grados da lugar a un cambio significativo en la tasa de crecimiento, teniendo en cuenta que cada especie posee en cualquier etapa de su ciclo de vida, y para cualquier conjunto de condiciones de estudio, una temperatura mínima por debajo de la cual no crece, una temperatura óptima (o rango de temperaturas) a la cual crece a máxima velocidad, y una temperatura máxima por encima de la cual la planta no crece e incluso puede morir.

La oxidación fenólica es un factor importante que puede ocasionar serios problemas en el establecimiento y la supervivencia de los explantes de la mayoría de las especies. Cuando los tejidos son dañados se liberan compuestos fenólicos que se manifiestan con un ennegrecimiento del medio de cultivo alrededor del explante, que se puede extender a todo el medio, provocar daños al crecimiento y hasta la muerte del explante.

Una de las prácticas más comunes para contrarrestar el efecto de la oxidación fenólica es agregar antioxidantes al medio de cultivo, los que son inhibidores de la polifenoloxidasa o adsorbentes. Entre los más empleados se pueden citar los ácidos ascórbico, cítrico y málico y carbón activado (Pedroza y Micán, 2006). Thorpe et al. (1991) recomiendan la adición de carbón activado, de 0,1- 5%, en el medio de cultivo para evitar los efectos de la oxidación de los explantes. En general, se usa para absorber compuestos tóxicos de la microatmósfera gaseosa o los reguladores de crecimiento en exceso que están presentes en el medio de cultivo.



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