Diversidad y estructura genética poblacional del cangrejo del manglar (Ucides occidentalis) en la región Tumbes, Perú



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Diversidad y estructura genética poblacional del cangrejo del manglar (Ucides occidentalis) en la región Tumbes, Perú. 2012 (Diversity and population genetic structure of magrove crab (Ucides occidentalis) in region of Tumbes, Peru. 2012)
Palabras clave: diversidad genética, estructura genética poblacional, Ucides occidentalis, citocromo oxidasa I
Keywords: genetic diversity, population genetic structure, Ucides occidentalis, cytochromo oxydase I

RESUMEN

La presente investigación tuvo como objetivo determinar la diversidad genética y la estructura genético poblacional del cangrejo del manglar Ucides occidentalis en el manglar de Tumbes el año 2012. La investigación se realizó entre junio y julio de 2012 en 3 zonas del manglar tumbesino: la zona norte (Zarumilla), la zona centro (Puerto Pizarro) y la zona sur (Corrales), en cada una de las zonas se establecieron 3 puntos de muestreo. Se recolectaron 55 ejemplares de U. occidentalis, extrayéndoseles a cada uno, muestras de hemolinfa y músculo, totalizando 110 muestras que se usaron para realizar el proceso de amplificación de un fragmento del gen mitocondrial de la subunidad I de la citocromo oxidasa (COI). La extracción del ADN se realizó mediante el método del cetil trimetil bromuro amonio (CTAB). De las 110 muestras se seleccionaron 56 para ser amplificadas mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR), 52 fueron amplificadas exitosamente, y de éstas, 45 fueron enviadas a la Empresa Macrogen en EE.UU. para ser secuenciadas, obteniéndose la secuencia de 42 de ellas, éstas fueron alineadas y se obtuvo secuencias de 543 pb para el análisis. Los resultados mostraron que las secuencias tuvieron similitud de 85 % a 87 % con secuencias almacenadas en GenBank correspondientes a fragmentos del gen COI de varios cangrejos. Respecto a la diversidad genética se determinó un alto índice de diversidad medido a través de los parámetros: número de haplotipos (h): 30, frecuencia del haplotipo más frecuente: 14,29 % y diversidad de haplotipos: 0,9721; promedio de diferencias en nucleótidos: 4,396 y diversidad nucléotida (π): 0,00810. En cuanto a la estructura genético poblacional, se determinó utilizando el análisis de varianza molecular (AMOVA) que fue bastante baja, dado que, el 96 % de la variabilidad genética se presentó entre los individuos dentro de las poblaciones y sólo 4 % entre las poblaciones; de igual manera, se determinó utilizando el test de Mantel que no existió correlación (r=-0,035, R2=0,0013) entre la matriz de distancia geográfica y la matriz de distancia genética. Se concluyó que la diversidad genética fue alta y la estructura genética poblacional baja en U. occidentalis en el manglar de Tumbes el año 2012.


ABSTRACT

The present study aimed to determine the genetic diversity and population genetic structure of mangrove crab Ucides occidentalis in Tumbes mangroves by 2012. The research was conducted between June and July 2012 in three areas of Tumbes mangroves: the north (Zarumilla), the central (Puerto Pizarro) and the south (Corrales), in each of the areas were established three points sampling. 55 specimens of U. occidentalis were collected and hemolymph and muscle samples were extracted from they, totaling 110 samples were used to perform the process of amplifying a gene fragment of mitochondrial subunit I of cytochrome oxidase (COI). DNA extraction was performed by the cetyl trimethyl ammonium bromide method (CTAB). Of the 110 samples were selected to be amplified by 56 polymerase chain reaction (PCR), 52 were successfully amplified, and of these, 45 were sent to Macrogen Company in USA to be sequenced. 42 were successfully sequencied, they were aligned and 543 bp sequences obtained for analysis. The results showed that the sequences were a similarity of 85 % to 87 % with sequences stored in GenBank of gene fragments of COI corresponding to various crabs. Regarding genetic diversity was determined high diversity index measured through the following parameters: number of haplotypes (h) 30, the most frequent haplotype frequency: 14.29 % and haplotype diversity: 0.9721; nucleotide differences in average: 4.396 and nucleotide diversity (π): 0.00810. In terms of population genetic structure was determined using analysis of molecular variance (AMOVA) was quite low because 96 % of the genetic variability occurred among individuals within populations and only 4 % among populations, likewise, was determined using the Mantel test that there was no correlation (r = -0.035, R2 = 0.0013) between the matrix of geographical distance and genetic distance matrix. It was concluded that genetic diversity was high and population genetic structure was low in U. occidentalis in mangroves of Tumbes in 2012.


TIPO DE TRABAJO:

Tesis para obtener el grado de Maestro en Acuicultura y Gestión Ambiental, presentada a la Escuela de Posgrado de la Universidad Nacional de Tumbes. Este trabajo es inédito y propiedad del autor del presente artículo


DESCRIPCIÓN DE LOS RECURSOS:

El documento completo de la investigación está estructurado en base a texto y figuras (gráficos estadísticos y fotografías) y se estima un espacio de almacenamiento de 1,5 Mb.





  1. INTRODUCCIÓN.

El cangrejo del manglar (Ucides occidentalis) es una de las especies más importantes del ecosistema del manglar americano en la cuenca del Pacífico. Ecológicamente es una especie clave por encargarse del reciclamiento de hasta el 80 % de la hojarasca del mangle, también ayuda a airear el suelo del manglar, cuando construye sus cuevas, potenciando la actividad de las bacterias aeróbicas que descomponen la materia orgánica (Solano, 2006).


U. occidentalis es también el cangrejo más explotado del manglar de la región Tumbes (Perú); lo que ha conllevado a que su población haya disminuido drásticamente, reduciéndose de 120 millones en 1996 a 77,06 millones en 2007, es decir una disminución del 35,8 % de la población en 11 años (Ordinola, Montero y Gonzales, 2010).

La reducción drástica del tamaño poblacional podría también originar una reducción de la diversidad genética poblacional, entendiéndose ésta como la diversidad de alelos que están presentes en una población y su frecuencia relativa en la misma. La diversidad genética constituye una reserva genética que permite que la especie pueda resistir a amenazas a su supervivencia como son las enfermedades, los cambios climáticos o cambios en el equilibrio ecológico.


La situación en la que se encuentra el cangrejo del manglar tumbesino es similar a la del cangrejo del manglar brasileño o cangrejo uça (Ucides cordatus), el cual debido a la captura indiscriminada, a la degradación de su hábitat y a la aparición de una enfermedad denominada síndrome del cangrejo letárgico, redujo drásticamente su población. Todo ello impulsó a que a partir de 2001, se iniciaran programas de repoblamiento con producciones masivas de larvas de U. cordatus y su liberación al medio natural (Ventura, 2006; Silva, 2007; Ventura et al., 2010).
Actualmente se está estudiando la diversidad genética de U. cordatus a fin de mejorar las estrategias de manejo del repoblamiento (Oliveira, 2009).
La diversidad o variación genética es la materia prima sobre la que actúa la selección natural para dar origen a adaptaciones; se ha llegado a considerar su presencia como indicadora de la buena salud de una población (Moreno, 2007).

La diversidad genética se refiere a la variabilidad encontrada dentro de los genes basada en las diferentes secuencias de nucleótidos que los forman, estas formas alternativas del gen se denominan alelos. Los alelos son las entidades que permiten definir la diversidad genética, la cual se conceptualiza como los diferentes tipos de alelos que están presentes y su frecuencia relativa entre todos los miembros de una población; la diversidad genética se puede medir a diferentes escalas: dentro de los individuos, a nivel de población o entre poblaciones (González, 2008).


La diversidad genética entre las poblaciones, se puede hallar distribuida de manera uniforme o no, conformando lo que se denomina estructura genética poblacional y que formalmente se define como la cantidad y la distribución de la variabilidad genética dentro de las poblaciones (Henríquez, 2003); por otra parte González (2008); indica que existe una estructuración genética intrapoblacional cuando las frecuencias alélicas no se distribuyen al azar, sino que siguen un determinado patrón o arquitectura que bien puede ser espacial o temporal. Por su parte, la estructura genética interpoblacional es el resultado de la distribución geográfica y en el espacio de subpoblaciones entre las cuales existen diferencias genéticas; dicha estructura genética es producto de la acción de las 4 principales fuerzas evolutivas: la tasa de mutación, la deriva génica, el flujo genético y la selección natural.
Excoffier, Smouse and Quattro (1992) desarrollaron el análisis de varianza molecular (AMOVA) para estimar la diferenciación de las poblaciones directamente desde datos moleculares y probar hipótesis acerca de la estructura genética poblacional, evaluando la diversidad genética en tres niveles: diversidad entre grupos de poblaciones, diversidad entre las poblaciones dentro de los grupos y la diversidad entre los individuos dentro de la población. AMOVA puede trabajar con datos de marcadores moleculares tales como: RFLP, AFLP e incluso con secuencias de ADN.
La diversidad genética de los organismos se mide a través de marcadores moleculares que corresponden a cualquier gen cuya expresión permite un efecto cuantificable u observable (características fenotípicas), y que además puede detectarse fácilmente. Existen dos tipos de marcadores moleculares: los marcadores bioquímicos y los marcadores de ADN (Solís y Torres, 2005).

Los marcadores de ADN pueden ser de ADN nuclear (ADNn) o mitocondrial (ADNmt) (Arif and Khan, 2009); Shih et al. (2011), ha señalado que las secuencias de ADNmt son apropiadas para evaluar la estructura genética y la filogeografía pues tienen las siguientes ventajas: hay miles de copias del ADNmt en cada célula, son haploides y se hereda únicamente por línea materna (Waples et al., 1999 citado en Ewald, 2006), se degradan más lentamente que el ADNn y evolucionan hasta 10 veces más rápido que el ADNn (Shih et al., 2011; Ewald, 2006).


El ADN mitocondrial (ADNmt) de los crustáceos es similar al del resto del reino animal, se trata de una molécula de ADN haploide que se hereda por vía materna y tiene un tamaño que oscila entre 15 000 a 17 000 pares de bases (pb), con una forma cerrada o circular. El ADNmt codifica 37 genes, de los cuales, 2 son genes ribosomales (12S rADN y 16S rADN), 22 son genes que codifican para ARN de transferencia (ARNt) y 13 son genes que codifican para proteínas, entre ellos las de la citocromo oxidasa (Ewald, 2006).
La citocromo oxidasa es una enzima propia de las mitocondrias y algunas bacterias, que forma parte de la cadena de transporte de electrones que permite formar el adenosintrifosfato (ATP). La enzima está formada por 13 subunidades, de las cuales 10 se codifican en el ADNn y 3 en el ADNmt, estas últimas corresponden a las denominadas citocromo oxidasa I (COI), citocromo oxidasa II (COII) y citocromo oxidasa III (COIII).

El gen que codifica a la COI es uno de los genes con alta tasa de mutación por lo que puede ser utilizado para distinguir diferencias genéticas a nivel de individuos. Folmer et al. (1994) han diseñado un juego de primers universales para poder amplificar un fragmento del gen COI a través un gran conjunto de invertebrados; dichos primers son:


Primer forward LCO1490: 5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'

Primer reverse HCO2198: 5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'
Estos primers han sido utilizados para amplificar un fragmento del gen COI para estudir la diversidad genética y estructura genética poblacional en muchos crustáceos tales como: el cangrejo verde Carcinus maenas (Roman and Palumbi, 2004), el cangrejo de río Potamonautes perlatus (Daniels, 2003), el cangrejo de río Austropotamobius torrentium (Schubart and Huber, 2006), la langosta espinosa de California Panulirus interruptus (García and Pérez, 2006) e incluso en el cangrejo del manglar brasileño U. cordatus (Ewald, 2006). Estos estudios muestran la gran utilidad del gen COI para estudiar la diversidad y estructura genética poblacional, sin embargo hasta la fecha no han sido empleados para evaluar la diversidad en U. occidentalis
U. occidentalis, ha sido poco estudiado en aspectos básicos y menos aún al nivel genético; existe un único trabajo realizado porr Ratti y Muñoz (2010) quienes optimizaron el sistema AFLP para la determinación de la variabilidad genética de U. occidentalis en 3 zonas del manglar del Golfo de Guayaquil (Ecuador); estos autores determinaron que la técnica de AFLP demostró ser útil para determinar la diversidad genética de U. occidentalis, adicionalmente encontraron un bajo nivel de diversidad genética entre las poblaciones evaluadas (con un índice de fijación de Wright o Fst de 0,0163); aparentemente la deriva génica fue la responsable, mientras que la migración no pareció ser una fuerza evolutiva que influyó significativamente en la variación.
El cangrejo del manglar brasileño ha sido mejor estudiado a nivel genético, se puede mencionar los trabajos de Oliveira (2009) quien estudió la diversidad genética de U. cordatus en la costa del Brasil, a nivel local (puntos de muestreo distantes un máximo de 100 km) y regional (puntos de muestreo distantes más de 5 000 km) mediante 4 técnicas: RAPD, PCR-RFLP, secuenciamiento del D-Loop y microsatélites, estas técnicas fueron aplicadas a 99 individuos en el estudio a escala local y a 280 individuos en el estudio a escala regional, encontrando en ambos alta diversidad genética con niveles de estructuración geográfica extremamente bajos o nulos. Los resultados de los análisis utilizando microsatélites mostraron mayor grado de estructuración, aunque siempre bajos. Estos resultados muestran que es posible el flujo génico entre poblaciones muy alejadas (separadas por cerca de 4 500 km) y que incluso la desembocadura del Río Amazonas, no constituyó una barrera para la migración de las larvas de este cangrejo. Estos resultados son compatibles con una estrategia reproductiva de exportación de larvas y amplio flujo génico entre todas las poblaciones estudiadas.
En otra investigación realizada sobre U. cordatus, Pie et al. (2008), estudiaron 5 ejemplares de este cangrejo recolectados en la bahía de Guaratuba, en Brasil, de los cuales se obtuvo ADNmt y se amplificó un fragmento de la región de control (CR), determinando la existencia de un considerable nivel de variabilidad medida como función entrópica de la variabilidad nucleotídica que llegó a 42,7 %.

De igual manera, Britto et al. (2009) realizaron un estudio utilizando marcadores microsatélite para evaluar una muestra de 46 ejemplares de Ucides cordatus procedentes de los manglares brasileños, encontrando que el número de alelos en cada locus estudiado varió de 3 a 25, con una media de 9 alelos. Los niveles de heterocigosidad observada (0,709 ± 0,183) y esperada (0,716 ± 0,170) fueron altos mostrando también una diversidad genética alta.


En este mismo sentido, se puede mencionar la investigación realizada por Ewald (2006) quien determinó la diversidad y estructura poblacional de U. cordatus utilizando como marcador molecular un fragmento del gen COI amplificado usando los mismos primers que los empleados en esta investigación (LCO1490 y HCO2198), este autor recolectó 223 ejemplares de U. cordatus en tres zonas: Amapa (al norte del río Amazonas), Pará y Maranhão (al sur del río Amazonas) y São Paulo y Paraná (en el sur de Brasil). La zona al norte y al sur del río Amazonas fue seleccionada a pesar de su relativa cercanía (200 km), debido a que el río Amazonas podría representar la mayor barrera geográfica tanto para juveniles, adultos, así como para la dispersión de las larvas. La zona al sur de Brasil distó más de 5000 km de la zona al sur del Amazonas. De los ejemplares recolectados, se extrajo muestras del músculo que se usaron para amplificar y secuenciar un fragmento del gen COI de 600 pb. Estas secuencias fueron alineadas mostrando 101 posiciones variables y ninguna brecha (gap) en el alineamiento. La traducción de la secuencia de nucléotidos usando el código mitocondrial no mostró codones de detención en la secuencia de aminoácidos. Este autor también realizó la búsqueda usando Nucleotide Blast en la base de datos de GenBank encontrando que sus secuencias tenían alta similaridad con las secuencias parciales de COI del cangrejo Portunus trituberculatus (número de acceso: AY303613) con una identidad de 84 %. Adicionalmente encontró similaridad con genes COI de otros crustáceos como Celuca pugilator AF466700, Munida sp. AY351029, Gaetice depressus AF317339, Pseudocarcinus gigas AY562127, Hemigrapsus oregonensis DQ022526.
Al analizar la diversidad genética Ewald (2006), encontró en los 223 individuos muestreados, 132 haplotipos distintos; 103 de los cuales fueron únicos, 27 aparecieron entre 2 a 5 veces, 1 apareció 9 veces; el haplotipo #H_3 fue el más frecuente estando presente en 35 individuos. El número promedio de diferencias nucleotídicas por parejas en 600 pb fue de 3,87 pb.

Respecto a la distribución de la composición nucleótida Ewald (2006) reporta en su investigación en diferentes poblaciones que ésta tuvo un alto contenido de adenina y timina (AT) como se observa en muchos ADN mitocondriales. La citosina ocurrió con una frecuencia de 20,75 %, la timina con 33,10 %, la adenina con 29,8 % y la guanina con 16,35 %.


Los haplotipos hallados por Ewald (2006) fueron 24 para 43 individuos del norte de Amazonas, 50 para 102 individuos en el sur del Amazonas y 41 para 78 individuos la del sur del Brasil. Las poblaciones del norte y el sur del Amazonas compartieron 3 haplotipos, las del norte del Amazonas y del sur del Brasil 5 y las del sur del Amazonas y sur del Brasil 6. Las 3 poblaciones compartieron solo 4 haplotipos, siendo un único haplotipo el #H_3 el más frecuente al ser encontrado en 35 individuos.
Las 3 poblaciones estudiadas por Ewald (2006) mostraron valores altos de haplotipos (diversidad de genes H= 0,97) y diversidad nucleótida (π = 0,0063 a 0,0065). Las poblaciones mostraron poca diferenciación medida a través del valor Φst que fue menor al 5 %, que se debe a una baja estructuración genética de las poblaciones. Los valores más altos fueron encontrados entre las poblaciones de la zona al norte del Amazonas y la zona al sur de Brasil (0,0393).
Ewald (2006) también evaluó el grado de estructuración genética dentro y entre las poblaciones de U. cordatus usando AMOVA con diferentes composiciones de grupos, la variabilidad más alta se dio entre los individuos de la población (97,44 %), mientras que la variabilidad entre poblaciones fue sólo de 2,56 % con un Φst de 0,0256.
Ewald (2006) concluyó que en las poblaciones estudiadas, existió alta diversidad genética y muy baja estructuración genética poblacional, argumentando que el efecto de la migración (flujo génico) fue el factor homogenizador entre las poblaciones; que dicha migración se da en la etapa larval cuando éstas salen al mar y son arrastradas por las corrientes; y que ni siquiera la desembocadura del río Amazonas fue una barrera geográfica que pudiese limitar el intercambio de larvas entre las diferentes zonas.
En todas las investigaciones en que se ha evaluado la diversidad genética y la estructura genética poblacional en U. cordatus, se ha determinado que poseen una alta diversidad genética y un bajo nivel de estructura genética poblacional, esto contrasta con el caso de que la única investigación encontrada sobre diversidad genética en U. occidentalis (Ratti y Muñoz, 2010) han indicado una diversidad baja. Sin embargo, lo más probable es que la diversidad sea alta dado que el flujo génico en estas especies es asegurado por la exportación de larvas que salen al mar y son arrastradas por las corrientes asegurando una adecuada migración lo cual incrementa las posibilidades de mantener una diversidad genética mayor y disminuir la estructuración genética.
La presente investigación tuvo como objetivos:

  • Determinar el nivel de diversidad genética en la población de U. occidentalis en los manglares de la región Tumbes el año 2012.

  • Determinar el nivel de estructura genética poblacional que existe en la población de U. occidentalis en los manglares de la región Tumbes el año 2012.




  1. MATERIAL Y MÉTODOS

La investigación se realizó entre junio a julio de 2012. Las zonas de muestreo correspondieron a las 3 áreas del manglar de Tumbes, que son muestreadas por el Imarpe y que son: zona norte (Zarumilla), zona centro (Puerto Pizarro) y zona sur (Corrales); en cada zona se establecieron 3 puntos de muestreo (Figura 1) y en cada una de ellas se obtuvo el número de cangrejos que se muestran en la tabla 1.


Tabla 1. Ejemplares de U. occidentalis recolectados por estación de muestreo

Zona

Canal de
marea o isla

Coord geográficas




Coord UTM

Ejemplares recolect.

Latitud

Longitud




X(m)

Y(m)

Norte

Zarumilla

03° 26’ 36,5” S

80° 16’ 05,2” O




581297

9619357

7

(Zarumilla)

El Algarrobo

03° 26’ 44,6” S

80° 15’ 49,4” O




581784

9619108

6




Isla Matapalo

03° 26’ 19,8” S

80° 16’ 43,3” O




580122

9619871

6

























Centro

Jelí

03° 29' 37,5" S

80° 22' 16,2" O




569846

9613807

6

(Puerto

Isla El Tanque

03° 30' 07,4" S

80° 23' 56,1" O




566763

9612891

6

Pizarro)

El Monteo

03° 30' 53,0" S

80° 25' 16,4" O




564284

9611493

6

























Sur

La Chepa

03° 33’ 50,1” S

80° 31’ 31,2” O




552718

9606061

6

(Corrales)

Corrales

03° 33’ 11,7” S

80° 31’ 06,4” O




553483

9607240

6




Corrales

03° 32’ 32,8” S

80° 30’ 49,6” O




554002

9608434

6

























Total



















55

Figura 1. Mapa del manglar tumbesino señalando las 9 estaciones de muestreo.


La recolección de U. occidentalis la realizó un recolector (cangrejero) durante el periodo en que la marea bajaba. De cada estación de muestreo se obtuvo 6 cangrejos, a excepción de la estación 1 del canal de marea de Zarumilla en que se obtuvo 7.
De cada cangrejo se obtuvo muestras de hemolinfa, para lo cual se siguió una metodología modificada basada en la empleada por Ratti y Muñoz (2010), que consistió en tomar 1 ml de hemolinfa de cada individuo por medio de una punción con jeringuilla de 5 ml, conteniendo 1 ml de solución de citrato de sodio al 10 %, pH 7,5 en las articulaciones de los quelípedos.
Se colocó 1 ml de la hemolinfa colectada en su respectivo microtubo eppendorf de 1,5 ml el que fue rotulado indicando la zona de extracción y el número de ejemplar; la hemolinfa fue colocada en un congelador para su posterior procesamiento.
Se extrajo con un bisturí 0,1 g de músculo de los periópodos o quelípodos de cada ejemplar, este músculo se colocó en su respectivo microtubo eppendorf de 1,5 ml conteniendo 1 ml de alcohol etílico al 95 %. El microtubo fue rotulado indicando la zona de extracción y el número de ejemplar para luego ser colocado en un congelador para su posterior procesamiento.
Las 110 muestras obtenidas (1 de hemolinfa y 1 de músculo de cada uno de los 55 ejemplares muestreados) fueron procesadas para extraer el ADN, de acuerdo al siguiente protocolo:
Los tubos eppendorf conteniendo las muestras de hemolinfa fueron centrifugados a 13 000 rpm durante 3 min en una centrífuga marca Sigma modelo 1-15K, la centrifugación tuvo como finalidad sedimentar los hemocitos. Luego, de cada uno de los tubos eppendorf se retiró el sobrenadante dejando en el tubo eppendorf los hemocitos sedimentados a los que luego se agregó 500 µl de solución CTAB y se homogenizó.
En el caso de los tubos conteniendo muestras de músculo, éstos fueron homogenizados dentro sus mismos tubos, usando maceradores de acero esterilizados.
Ambos tipos de muestras: hemolinfa y músculo posteriormente fueron procesados como sigue:
Se agregó 2 µl de proteinasa K (895 U/ml; 19,6 mg/ml marca Fermentas) a cada uno de los microtubos eppendorf, se les colocó seguros metálicos en sus tapas para evitar que éstas se abran con el calor, luego se les incubó en un equipo de baño maría marca Bionet modelo BM5, a 55 ºC durante 2 h. Pasado este tiempo se retiraron los tubos eppendorf y se les adicionó 1 µl de ARNasa a cada uno. Los tubos eppendorf fueron nuevamente incubados a 55 oC en el baño maría durante 10 min. Transcurrido dicho tiempo se agregó a cada tubo eppendorf: 300 µl de fenol saturado marca Invitrogen y 300 µl de cloroformo/alcohol isoamil marca Merck, y se centrifugó a 13 000 rpm durante 10 min.
En cada uno de los tubos eppendorf centrifugados se formaron 3 fases; la fase superior (el sobrenadante) se recuperó y se colocó en un nuevo tubo eppendorf etiquetado de la misma manera que el tubo original. Luego se agregó a cada uno de estos nuevos tubos, solución de cloroformo/alcohol isoamil en igual proporción que el sobrenadante recuperado, y se centrifugó a 13 000 rpm durante 10 min.
De cada tubo eppendorf centrifugado, se recuperó cierto volumen del sobrenadante (no menos de 150 µl) que fue colocado en un nuevo tubo eppendorf etiquetado de la misma manera que el tubo del que se retiró el sobrenadante; en cada uno de estos nuevos tubos se adicionó alcohol al 95 % helado, en cantidad equivalente al doble del volumen del sobrenadante recuperado. Se homogenizó el contenido de cada tubo eppendorf y se centrifugó a 13 000 rpm durante 10 min; luego de lo cual se observó que en el fondo de cada tubo eppendorf se formó un pellet de ADN. Se eliminó el líquido sobrenadante, dejando el pellet en el fondo del tubo eppendorf, luego se le agregó 1 ml de etanol al 75 % para realizar el lavado del ADN. Se centrifugó los tubos eppendorf a 10 000 rpm durante 2 min y se descartó el sobrenadante, dejando el pellet de ADN con la menor cantidad posible de líquido. Posteriormente se dejó secar el pellet de ADN manteniendo el tubo eppendorf destapado en una gradilla a temperatura ambiente durante al menos 10 min. Finalmente se resuspendió el pellet de ADN en 50 µl de solución TE 1X y se almacenó en un congelador vertical a -20 ºC.
De las 110 muestras de ADN extraídas, se seleccionaron 56 muestras para amplificar el fragmento del gen COI, para ello se tomaron de 5 a 8 muestras de ADN de la hemolinfa por cada estación de muestreo y en el caso de la zona de Corrales, también se seleccionaron 2 a 3 muestras de ADN del músculo.
Luego se calculó el número de reacciones necesarias para realizar la amplificación, siendo éste el número de muestras de ADN extraído que se debió amplificar al que se le adicionó una reacción más para el control negativo y otra para el control positivo. El volumen de mix (mezcla de reactivos) para realizar la amplificación se obtuvo multiplicando el número de reacciones antes calculado por los volúmenes de reactivos que se especifican en la tabla 2.
Tabla 2. Volumen de reactivos para preparar el mix necesario para una reacción de la PCR

Reactivo

Volumen(µl)

Agua ultra pura

16,75

Solución buffer 10X PCR RXn buffer (no incluye MgCl2) marca Invitrogen

2,50

MgCl2 (10 mM marca Invitrogen)

2,50

Mix de dNTP (desoxinucleótidos trifosfato) (10 mM marca Fermentas)

0,50

BSA (albúmina de suero bovino)

1,00







Primer directo LCO1490 (10 pMol/µl)

0,50

Primer inverso HCO2198 (10 pMol/µl marca Fermentas)

0,50

Taq polimerasa (5 U/ µl marca Invitrogen)

0,25

Total

24,50

La amplificación del ADN se realizó en un termociclador marca Techne modelo FTC3102D programado como se aprecia en la tabla 3:


Tabla 3. Programación del termociclador

Fase

Temperatura (ºC)

Tiempo

Número de ciclos

Pre desnaturalización

95

5 min

1

Amplificación







40

Desnaturalización

94

30 s




Hibridación

50

45 s




Polimerización

72

1 min




Polimerización final

72

7 min

1

Las 56 muestras en las que se realizó la amplificación del fragmento del gen COI mediante PCR, fueron sometidas a la electroforesis a fin de verificar si hubo o no amplificación, para lo cual se siguió el siguiente protocolo:


La migración de los amplicones se realizó en geles de agarosa al 2 % conteniendo 5 µl de bromuro de etidio, se utilizó como tampón de migración, 120 ml de TAE 1X y 2 µl de tampón de depósito al cual se agregó 10 µl de cada amplicón procedentes de la PCR. La migración se realizó a 68 V durante 30 min.
Los geles fueron visualizados utilizando un transiluminador marca UVP modelo White/UV, luego se realizaron fotografías digitales del mismo.
De las 56 muestras de ADN que se procesaron en la PCR, 52 fueron exitosamente amplificadas, de estas últimas se seleccionaron 45 para ser enviadas para el secuenciamiento del ADN, para lo cual se retiró 20 µl del producto obtenido por amplificación en la PCR y de los primers correspondientes, estos fueron colocados en tubos eppendorf de 0,5 ml y empacados en hielo seco para ser enviados a la empresa Macrogen en Maryland (EE.UU.) la que brindó el servicio de secuenciamiento del ADN.
Los resultados del secuenciamiento del ADN realizado por Macrogen fueron recibidos vía email; de las 45 muestras enviadas, solo 42 pudieron ser secuenciadas adecuadamente.
Las 42 secuencias nucleotídicas del fragmento del gen COI correspondientes a ejemplares de U. occidentalis, fueron alineadas entre sí utilizando el algoritmo ClustalW implementado en el software Mega versión 5 (Tamura et al., 2011).
Posteriormente se alineó dichas secuencias contra 2 secuencias reversas complementarias de cadenas antisentido del fragmento del gen COI de U. occidentalis (números de acceso de GenBank: JX524479 y JX524480) dichas secuencias fueron amplificadas utilizando los primers de Folmer et al. (1994) y se obtuvieron en un análisis previo realizado por el autor a 2 ejemplares de U. occidentalis en octubre de 2011. La alineación contra estas 2 secuencias permitió descartar nucleótidos no confiables en el extremo 3’ y 5’ de las secuencias investigadas, quedando reducidas cada una de las 42 secuencias de ADN a 543 pb.
Las secuencias fueron analizadas en Mega 5 y DnaSP 5.0, para determinar la composición nucleotídica.
Las secuencias recortadas y alineadas fueron verificadas contra la base de datos de GenBank (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) utilizando el software en línea Nucleotide Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (Zhang et al., 2000), buscando verificar si dichas secuencias tuvieron similitud con fragmentos del gen COI de organismos emparentados que estuvieron registrados en dicha base de datos.
A continuación las secuencias alineadas en Mega 5 fueron exportadas en formato mega y analizadas usando DnaSP 5.0 obteniendo el número de haplotipos (Nh), la diversidad de haplotipos (h), la diversidad nucléotida (π), estos mismos datos fueron exportados a GenAlex 6 (Peakall and Smouse, 2006) de donde se obtuvo la matriz de distancia genética de Nei (Nei and Li, 1979; Nei and Tajima, 1981; Nei, 1987 citado por Thaewnon et al., 2004).
La existencia de estructura genética poblacional se evaluó comparando la varianza genética entre y dentro de poblaciones haciendo uso del análisis molecular de varianza (AMOVA), así también se evaluó la correlación entre la distancia genética y la distancia geográfica mediante el test de Mantel, ambos análisis se procesaron utilizando el software GenAlex versión 6 (Peakall and Smouse, 2006).
Las 42 secuencias del fragmento del gen COI de U. occidentalis fueron enviadas a GenBank, habiéndoles sido asignado los números de acceso: JX564556 - JX564597.



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