Determinación del efecto del principio activo Hb 001 de Andrographis Paniculata en el Sistema Inmune



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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Facultad de Ciencias

Escuela de Química y Farmacia

Determinación del efecto del principio activo Hb 001 de Andrographis Paniculata en el Sistema Inmune

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico.

Profesor Patrocinante: Dr. Hugo Fölch V. – Instituto de Inmunología – Facultad de Medicina.

Valeska de Fátima Martínez Ochoa



Valdivia Chile 2003

Profesor Co-Patrocinante

Dr. Rafael Burgos A. - Instituto Farmacología - Facultad Veterinaria.

Dedicatoria

A mi Familia

Agradecimientos

En primer lugar y en forma muy especial, quiero agradecer al Doctor Hugo Fölch por toda la ayuda y el apoyo que me brindó durante la realización de mi tesis, por su buena disposición y por la confianza que depositó en mí.

A la srta. Marcela Ortega por su constante ayuda técnica y gran apoyo. A Priscilla Muñoz por su buena disposición y por el tiempo que se dio en todos esos momentos en que necesité de su cooperación.

A mis Papás y hermanas, por el cariño, ánimo y la fuerza necesaria que siempre me entregaron para seguir adelante y no decaer en momentos de flaqueza, por que sin su apoyo éste gran paso no habría podido alcanzarse.

A Hardy, por estar conmigo en todo momento, Gracias.

Finalmente agradezco a Dios por darme la fortaleza para alcanzar la meta.

Fuente de financiamiento: PROYECTO D01I1024, FONDEFF



Abreviaturas

- ºC GRADOS celsius

- CO2 dióxido de carbono

- Con A Concanavalina A

- c.s.p cantidad suficiente para

- ELISA Ensayo inmuno-absorción unido a Enzima

- H2O agua

- H2O2 peróxido de hidrógeno

- H2SO4 ácido sulfúrico

- IL-2 Interleuquina-2

- IL-4 Interleuquina-4

- IL-10 Interleuquina-10

- IFN-γ Interferón-gamma

- Kg kilogramos

- ml mililitros

- M Molar

- MHC complejo mayor de histocompatibilidad

- NK natural killer

- nm nanometros

- %p/v porcentaje peso-volumen

- pg picogramos

- PBS buffer salino fosfato

- SBF suero bovino fetal

- rpm revoluciones por minuto

- TMB Tetrametilbenzidina

- μg microgramos

- μl microlitros

1. RESUMEN


En este trabajo se estudió el efecto de HB 001, un componente de Andrographis paniculata, en la producción de citoquinas. Para este propósito, grupos de ratones de cepa Rockefeller fueron tratados con HB 001 o con el solvente por seis días consecutivos y se determinó la producción de citoquinas Th1 y Th2 por ELISA "sándwich"; en el sobrenadante de células linfoides cultivadas por 24 horas.

Los resultados obtenidos mostraron que HB 001 administrado in vivo aumenta la producción de IFN-γ e IL-2, consideradas entre las citoquinas Th1 más importantes. La producción de IL-4, una importante citoquina Th2 no se vio afectada por HB 001 en los diferentes experimentos. Con respecto a IL-10 también una citoquina perteneciente al grupo de las citoquinas Th2, los resultados obtenidos fueron mas variables dependiendo del origen de los órganos de las células estudiadas.

De estos resultados podemos concluir que HB 001 incrementa la actividad de células helper Th1, por lo que aumenta la respuesta inmune mediada por células, que incluye la hipersensibilidad de tipo retardada y actividad citotóxica de células T. Por otro lado, el compuesto HB 001 no afecta a las citoquinas tipo Th2 encargadas de co-activar a las células B y de esta manera ayudar a la generación de la respuesta inmune humoral dada por la secreción de inmunoglobulinas.

SUMMARY


In this work the effect in cytokine secretion of HB 001, a component of Andrographis paniculata was studied. For this purpose, groups of Rockefeller (RK) mice were treated with HB 001 or the solvent for six consecutive days and the secretion of Th1 and Th2 cytokines determined by ELISA "sandwich" in the supernatant of lymphoid cells cultered for twenty-four hours.

The results show that HB 001 in vivo increases the production of IFN-γ and IL-2, considered the most important Th1 cytokines. At the same time the production of IL-4, a relevant Th2 cytokine was not affected by HB 001. With respect to IL-10, another Th2 cytokine type, the results were more variable depending on the organ source for the cells studied.

From these results we may conclude that HB 001, increases the activity of Th1 helper cells, increases the cell mediated immune response, that include the delayed type of hypersensivity and cytotoxic activity of T cells. On the other hand, HB 001 did not affect the Th2 type of cytokines encharged of co-activate B cells and this way help in the generation on of the humoral response represented by the immunoglobulin secretion.

2. INTRODUCCION


El sistema inmunológico constituye un complejo mecanismo de defensa que poseen las especies de animales ubicados en la parte superior de la escala zoológica. Este sistema defensivo tiene la particularidad de responder en forma específica ante la aparición de agentes extraños, denominados antígenos que una vez que ingresan al organismo son capaces de neutralizarlos y eliminarlos (Roitt et al, 1997).

Cuando un antígeno entra al organismo ocurre una multitud de eventos relacionados entre sí. Primero el antígeno se combina con las inmunoglobulinas de membrana de las células B específicas para los determinantes antigénicos o epítopes del elemento extraño. En forma simultánea el antígeno es atrapado y destruido por el sistema reticulo-endotelial, compuesto por células fagocíticas dispuestas en todos los tejidos del organismo, en especial en los órganos linfoides como el bazo, nódulos linfáticos, el tejido linfoide asociado a mucosas y otros órganos de filtración como el hígado. Los encargados de esta acción depuradora son las células del tipo granulocítico y macrofágico derivado de los monócitos. Estas últimas células son especialmente eficientes en secretar citoquinas que por su origen son llamadas monoquinas y que tienen un papel determinante en la respuesta inmune específica. Por otro lado, los macrófagos estan encargados del procesamiento del antígeno para ser presentado a los linfocitos T. Este procesamiento consiste en la ingestión del antígeno, su inclusión en un fagolisozoma , su transformación en péptidos, unión de un pequeño porcentaje de estos a moléculas de antígenos de histocompatibilidad propios y su expresión en la membrana plasmática. Aquí son reconocidos en esta forma denaturada por el receptor de la células T, la que bajo la influencia de las monoquinas antes mencionadas, se activa dividiéndose y produciendo diversas citoquinas que hacen posible tanto la respuesta humoral como la respuesta inmune celular.

La respuesta inmune específica generada ante cualquier antígeno puede ser de tipo celular o humoral (Roitt et al, 1997), ambas dependen de los linfocitos que tienen su origen en células hematopoyéticas totipotenciales (células madres) ubicadas en la médula ósea, la progenie de estas células posteriormente se diferencian en linfocitos T o B responsables de la respuesta inmune celular y humoral, respectivamente. Adicionalmente a esta función efectora, los linfocitos T cumplen una importante función reguladora tanto para la respuesta inmune humoral como celular. De acuerdo a esto, los linfocitos T se pueden clasificar en linfocitos Th1, llamados también T helper inflamatorias, que son los encargados de activar la respuesta inmune celular contra diferentes antígenos (Flesh y Kaufmann, 1989) y los linfocitos Th2, los cuales son efectivos en la estimulación del crecimiento y diferenciación de los linfocitos B y por ende, encargados de modular en forma positiva la respuesta inmune humoral ( Abbas, 1988). Las células Th1 secretan principalmente IFN-γ, IL-2 y TNF y las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13.(Flesh y Kaufmann, 1989).

Las citoquinas son proteínas solubles de bajo peso molecular, que son producidas frente a un estímulo y que cumplen un rol como reguladores y promotores de crecimiento en la respuesta inmune (Palomo et al, 1998). Entre las citoquinas mas importantes en el desarrollo de la respuesta inmune se encuentran IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-γ. El IL-2 es producida por células T, principalmente CD-4+; pertenece a la población de linfocitos Th1 constituyendo para estos un importante factor de crecimiento. El IL-4 por otro lado induce la activación y diferenciación de células B, dando lugar a producción de IgG1 e IgE. Adicionalmente actúa como factor de crecimiento y diferenciación de células T promoviendo su diferenciación a células Th2. El IL-10 pertenece a la sub-población Th2. Este inhibe la producción de IFN-, la presentación del antígeno y la producción de otras citoquinas como, IL-1 e IL-6; cumpliendo un rol importante en la activación de células B y paralelamente en la supresión de la respuesta inmune celular. Finalmente, el IFN- γ es un potente regulador inmunitario, que activa a los macrófagos y la respuesta inmune celular. Es producido por las células T activadas del tipo Th1 y por las células asesinas naturales(NK) (Roitt et al, 1997).

La magnitud de la respuesta frente a un determinado estímulo antigénico depende de varios factores, unos dependen del antígeno y otros del huésped. En este último grupo adquiere especial relevancia la regulación inmune celular a cargo de las células Th1 y Th2 (Mossman et al, 1986). Estas poblaciones de linfocitos secretan linfoquinas que activan a un tipo particular de respuesta, (la Th1 activa la respuesta inmune celular y la Th2 la respuesta inmune humoral), enviando señales positivas, a cada una de estas ramas de la respuesta inmune y por otro lado antagonizando a la población helper contraria. De esta manera, generalmente la respuesta inmune resultante es predominantemente celular o predominantemente humoral , que es lo que hoy conocemos como "polarización de la respuesta inmune".

Al respecto se sabe que frente a infecciones por microorganismos intracelulares ( virus y algunas bacterias) la respuesta inmune celular comandada por células Th1, es fundamental. Esto se confirma al observar el curso que toman las enfermedades causadas por patógenos intracelulares, como tuberculosis, en pacientes en que la respuesta inmune celular está disminuida o no existe; se sabe que pacientes inmunodeficientes como aquellos que sufren el síndrome de George o los infectados con virus VIH, son presa fácil de este tipo de patología (Bancroft et al, 1991; Emmerling et al, 1974)

De acuerdo con lo acá expuesto resulta de gran interés práctico poder incrementar la eficiencia del sistema inmune, y contar con los medios para estimularla y mejor aún estimular o suprimir selectivamente la respuesta inmune celular o humoral.

Andrographis paniculata es una planta medicinal perteneciente a la familia Acanthaceae (Gupta et al , 1990), originaria de Asia, principalmente de China, India y Corea (Zhang y Tan, 1998). En estos Países ha sido ampliamente utilizada por los efectos beneficiosos que posee en diversas afecciones, entre las que se encuentra el resfrío común. Existen estudios al respecto, los cuales han demostrado exitosamente este beneficio. Esto ha hecho que se haya utilizado como materia prima para la elaboración de fármacos, que han demostrado ser efectivos en el alivio de los síntomas del resfrío común (Melchior et al , 1996)

Los principales componentes de estos extractos son lactonas diterpénicas y sesquiterpénicas, flavonoides y azúcares. Uno de estos constituyentes es el compuesto HB 001, una lactona diterpénica que se encuentra en alta concentración en A. paniculata, (Thamlikitkul et al , 1991) la cual es extraída de la parte aérea de la planta por medio de soluciones alcohólicas o alcalinas. A este compuesto se le atribuye la capacidad de estimular la respuesta inmune específica y no específica que se ha descrito para el extracto total de Andrographis paniculata (Puri et al , 1993)

Al respecto, se ha demostrado que la administración de 1.200 mg. diarios del extracto total durante cuatro días a individuos que están cursando un resfrío común, acorta su período de recuperación a la vez que es capaz de disminuir los signos y síntomas de la patología (Hancke et al, 1995). Estos resultados obtenidos sugieren que Andrographis paniculata tiene la facultad de prevenir y acelerar la curación del resfrío común. Como no se sabe con exactitud el mecanismo de acción de este conjunto de principios activos de origen vegetal ; el propósito de esta investigación es estudiar el efecto de un constituyente de Andrographis paniculata, el "HB 001" en la producción de citoquinas tipo Th1 y Th2.

En base a los antecedentes mencionados se ha formulado la siguiente Hipótesis de trabajo:

“ El efecto inmunoestimulante de Andrographis paniculata se debe a que HB 001 es capaz de estimular un aumento de la producción de citoquinas del tipo Th1 en los linfocitos T, aumentando de esta forma la respuesta inmune celular”.

Como objetivo general se ha fijado:

“Demostrar que el compuesto HB 001 extraído de Andrographis paniculata, es capaz de aumentar las citoquinas tipo Th1”.

Los objetivos específicos son:

* Verificar que el compuesto HB 001 aumenta la producción de IFN-γ.

* Demostrar que el compuesto HB 001 aumenta la producción de IL-2.

* Probar que el mismo principio activo no ejerce efecto sobre citoquinas tipo Th2: IL-4 e IL-10.

3. MATERIALES Y METODOS


1.- ANIMALES

Se usaron como animales de experimentación ratones de la cepa “Rockefeller” (RK) provenientes del vivero del Instituto de Inmunología de la Universidad Austral de Chile.

Para cada experimento se utilizaron grupos de ratones del mismo sexo y edad constituido por cuatro ratones cada uno, los cuales se mantuvieron en cajas a una Tº de 20º C y alimentados con concentrado especial para ratones y agua “ad libitum”.

2.- PRINCIPIO ACTIVO

En todos los experimentos de la presente tesis se uso el compuesto HB 001 obtenido de Andrographis paniculata, adquiridos al Laboratorio AMSAR PRIVATE LTDA. HB 001 fue usado para pretratar a los animales experimentales que posteriormente fueron los dadores de células linfoides usadas en cultivo. HB 001 se uso en concentraciones de 0,224; 2,24 y 22,4 μg/kg, diluido en etanol al 0,08%, además de un grupo control constituido solo por el solvente. Los animales fueron inyectados diariamente con 200 μl de cada concentración, por vía intraperitoneal, durante seis veces consecutivas a menos que se especifique alguna modificación particular de este esquema.



3.- INMUNIZACION

En algunos diseños experimentales que lo requerían, los grupos de animales fueron inmunizados por vía intraperitoneal con 100 μl de la cepa RB-51 en una concentración de 108 células de brucela o alternativamente con 2 μl de proteína total de brucela RB-51 en una concentración de 2,5 g, en forma de emulsión con coadyuvante incompleto de Freund (CIF), inyectados en los cojinetes plantares de los miembros posteriores. Esta inyección se efectuó bajo anestesia general.



4.- ESTIMULACION DE LINFOCITOS “IN VITRO” PARA INDUCIR LA PRODUCCION DE CITOQUINAS

Como estimulantes “in vitro” para linfocitos tanto de bazo como de nódulos popliteos se utilizaron:

El mitógeno Concanavalina A (Con A) a las concentraciones de 10 μg/ ml.

Proteína total de Brucella abortus cepa RB-51 a las concentraciones de 10 μg/ ml.



Brucella abortus cepa RB-51 muerta por calor en un número de 108 y 106 células por ml de cultivo.

5.- OBTENCION DE LOS ORGANOS LINFOIDES Y CULTIVO DE ESTOS PARA ESTUDIO DE RESPUESTA INMUNE

Para la obtención de los órganos linfoides, los animales de los distintos grupos fueron sacrificados por inhalación excesiva de éter. Luego se extrajeron de estos los nódulos popliteos inguinales o bazo según el protocolo del experimento. Estos órganos contienen un 40% y un 60% de linfocitos T, respectivamente. Se asume que los efectos observados corresponden a los linfocitos T y mas precisamente a las células T helper (CD-4+), ya que son las que primariamente se estimulan con Concanavalina A o con el antígeno de Brucella en las condiciones experimentales usadas en este trabajo. Los órganos fueron depositados en placas Petri para cultivo conteniendo 5 ml de medio de cultivo RPMI 1640. Las células linfoides se obtuvieron disgregando estos órganos en medio de cultivo RPMI 1640 completo estéril, y los linfocitos obtenidos fueron lavados y resuspendidos en 1 ml de medio RPMI 1640 completo y cuantificados mediante recuento en cámara de Neubauer. Finalmente, la suspensión de linfocitos fue ajustada a una concentración de 4x106 células por ml en RPMI completo. Una vez obtenidas las células, éstas fueron cultivadas en presencia de diferentes mitógenos y antígenos. Para este objetivo se usaron placas de cultivo de poliestireno de 24 pocillos de 2 ml cada uno; en cada uno de los cuales se colocó 1 ml de células provenientes de animales tratados con las distintas concentraciones de HB 001, más 1 ml del mitógeno o antígeno utilizado según el diseño del experimento. Para el caso de producción espontánea de citoquinas se colocó un ml de RPMI.

Las placas fueron incubadas en una estufa a 37º C , en una atmósfera de humedad, con un 5% de CO2 por 24 horas. Transcurrido este período se tomaron las muestras de 2 ml cada una y fueron sometidas a centrifugación por un minuto a 3200 rpm. y los sobrenadantes de los cultivos fueron congelados en alícuotas de 0,6 ml para la posterior medición de citoquinas mediante la técnica de ELISA.

6.- DETERMINACION DE CITOQUINAS SECRETADAS IN VITRO

Para la determinación de la liberación de citoquinas al medio, por los linfocitos de bazo o de ganglios utilizados para los distintos experimentos, se contó con diferentes Kit comerciales los cuales fueron adquiridos al Laboratorio Pharmingen. En todos los experimentos se utilizaron kit de IL-2, IL-4, IL-10 e IFN-γ. Cada kit está conformado por un primer anticuerpo de captura anti-antígeno, un segundo anticuerpo conjugado a una enzima peroxidasa y una solución estándar de la citoquina para la elaboración de la curva de calibración. Para estudiar la producción de las citoquinas se recurrió a la técnica de ELISA “sándwich”, llamado también ELISA de captura.

Con el fin de evaluar el tipo de respuesta en cada caso se determinó la producción de citoquinas tipo Th1 como son: IL-2 e IFN-γ y tipo Th2 como son: IL-4 e IL-10. En cada experimento se utilizaron placas para ELISA “high binding” (alta unión), de poliestireno de 96 pocillos, procediéndose a sembrar 100 μl por pocillo del primer anticuerpo llamado también “ de captura”, el cual fue diluido en buffer carbonato pH 9,5 con el fin de facilitar la unión a la placa. Esta se dejó incubar por toda la noche a 4º C. para asegurarse que el anticuerpo se una totalmente a la fase sólida. Transcurrido este tiempo de incubación el contenido de la placa fue eliminado y lavada con 300 μl por pocillo con tween 20 0,05% p/v y PBS pH 7,0 por tres veces. Después de esto la placa fue bloqueada con 200 μl de leche descremada 5% más PBS, incubándose por una hora a Tº ambiente. Terminada esta etapa nuevamente se eliminó el contenido de los pocillos y se lavó tal como se indicó anteriormente. Luego se procedió a agregar las muestras problemas que contenían el antígeno, en una cantidad de 100 μl por pocillo y por duplicado, además en esta etapa se agregaron 100 μl de una curva de calibración específica para la citoquina que se estaba determinando; se incubó la placa durante dos horas a Tº ambiente. Posteriormente, se eliminó nuevamente el contenido de los pocillos y se lavó 5 veces siguiendo el protocolo de lavado anterior. Una vez hecho esto se procedió a colocar el segundo anticuerpo conjugado a peroxidasa y diluido en una solución de PBS y 10% de SBF en una cantidad de 100 μl por pocillo y se dejó a Tº ambiente por una hora. Pasado este período de tiempo la placa se lavó siete veces y se aplicó la solución reveladora de TMB y H2O2 (Josephy et al, 1982) en una cantidad de 100 μl por pocillo. La reacción se dejó desarrollar por 30 minutos en oscuridad. Finalmente, la reacción se detuvo con H2SO4 2 M en una cantidad de 50 μl por pocillo.

El resultado de la reacción de evaluó midiendo la absorbancia en un lector de ELISA con filtro de 450 nm (EIx800 universal Microplate Reader, Biotek).



7.- EXPRESION DE RESULTADOS

En cada medición de citoquina se realizó una curva de calibración, por lo cual haciendo una conversión de los valores de absorbancia obtenidas por el lector de ELISA, en la ecuación de la recta, se obtienen valores de concentración.

Finalmente los resultados son expresados en unidades de concentración del orden de pg/ml.

8.- ANALISIS ESTADISTICO

En todos los gráficos se efectuó un análisis estadístico. Se realizó el análisis no paramétrico de Kruska-wallis, seguido del test de comparaciones múltiples de Dunn`s. El nivel de significancia utilizado fue de p< 0,05.

Todos los análisis estadísticos y gráficos fueron realizados en el programa GRAPH PAD PRISM 3.0. El tipo de gráfico utilizado correspondió al de “barras”, con sus respectivas desviaciones estándares.

4. RESULTADOS

4.1- Producción espontánea de citoquinas en células de bazo de ratones tratados o no con diferentes dosis de HB-001.


Grupos de cuatro animales cada uno fueron inyectados por seis días consecutivos con distintas dosis de HB 001, posteriormente se inmunizaron con la vacuna RB-51 a una dosis de 108 bacterias por ratón y luego de tres semanas se sacrificaron. Las células esplénicas obtenidas de estos animales fueron incubadas sin estímulo adicional en medio RPMI 1640 por 24 horas. Como puede observarse en la figura 1 el tratamiento in vivo con el compuesto en ratones inmunizados incrementa la producción espontánea in vitro de IFN-γ. Para el caso de IL-2, se observa una tendencia a aumentar, ya que al hacer el análisis estadístico correspondiente, éste dio como resultado p > 0,05, por lo que estos resultados no son significativos. Por otro lado, este efecto estimulante no se evidencia para las citoquinas IL-4 e IL-10, en que el compuesto en estudio, no produjo efecto en la producción de estas citoquinas. Los resultados de cada gráfico representa un promedio de cuatro experimentos hechos por separado y en diferentes fechas, bajo las mismas condiciones.

FIGURA 1. producción espontánea de citoquinas, por células esplénicas provenientes de animales tratados con diferentes cantidades de HB o del grupo control inyectado con el solvente e inmunizados con la vacuna B. Abortus RB-51. Los niveles de producción de citoquinas IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 son mostradas en las figuras A, B, C y D respectivamente. Cada una de las barras representa el promedio de los resultados obtenidos en cuatro experimentos con su desviación estándar.

Cuando se analizaron los resultados correspondientes a la secreción de citoquinas en forma espontánea, en los experimentos en que los animales dadores de células no estaban inmunizados, es decir, solo habían recibido el compuesto HB 001 por los mismos seis días y sacrificados al séptimo día, se puede apreciar que se produjo un aumento de IFN-γ en los animales en que se uso como pretratamiento la concentración más alta del compuesto. Por otro lado se observa que no hubo efecto en la producción de IL-2, en los distintos grupos experimentales. En el caso de citoquinas Th2, el IL-4 tampoco muestra variación entre los animales tratados con HB 001 respecto del grupo control tratado con el solvente del principio activo. Estos resultados son mostrados en la figura 2, los cuales corresponden a un promedio de tres experimentos efectuados en las mismas condiciones.



FIGURA 2. producción espontánea de citoquinas por células esplénicas de animales tratados con diferentes dosis del compuesto HB 001 y un grupo control tratado con solvente, cultivados en placa por 24 horas. En los gráficos A, B y C se muestra la producción de las citoquinas IFN-γ, IL-2 e IL-4 respectivamente. Cada barra representa el promedio de tres experimentos con su respectiva desviación estándar.


4.2- Efecto del tratamiento con HB 001 en la producción de citoquinas inducida en células esplénicas con Concanavalina A.


Grupos de ratones tratados o no por seis días consecutivos con HB 001, fueron sacrificados un día después de finalizado el tratamiento, y sus células esplénicas obtenidas en medio completo fueron cultivadas en presencia del mitógeno Concanavalina A por 24 horas. En los siguientes gráficos se aprecian los resultados obtenidos como promedio de tres experimentos distintos efectuados bajo las mismas condiciones con su correspondiente desviación estándar. Como se muestra en la figura 3, los animales tratados con las distintas concentraciones del producto responden con una tendencia a aumentar, en lo que respecta a la producción de las citoquinas Th1, IFN-γ e IL-2. En cuanto a las citoquinas Th2, se aprecia que el IL-4 se mantiene constante en todos los grupos estudiados y en el caso de IL-10 se puede observar que HB 001 induce en las condiciones experimentales estudiadas, una disminución de su producción en los distintos grupos de animales tratados.

FIGURA 3. producción de citoquinas por células esplénicas provenientes de animales tratados con distintas dosis de HB 001 o con solvente como control. Las células obtenidas de estos animales fueron cultivadas por 24 horas en presencia de Con A ( 10 μg/ml) o en ausencia del mitógeno ( ). La producción de las citoquinas IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 se muestran en los gráficos A, B, C y D respectivamente, en que cada barra representa el promedio de tres experimentos con su desviación estándar.


4.3- Efecto del tratamiento con HB 001 en la producción de citoquinas de células de bazo en ratones inyectados con la vacuna Brucella abortus RB-51 y cultivados en presencia de este antígeno.


En esta serie experimental los distintos grupos de animales fueron tratados o no con HB 001 por seis días consecutivos y el séptimo día se inyectaron por vía intraperitoneal con 108 células vivas de Brucella abortus RB-51, en un volumen de 100 μl por ratón , 21 días después los animales se sacrificaron y los linfocitos de bazo extraídos, fueron cultivados en presencia de 10 g de proteína total de brucela por 24 horas junto a un control con RPMI completo. Como puede verse en la figura 4 con este modelo experimental no fue posible evidenciar un cambio en la producción de citoquinas en los diferentes grupos experimentales. Esto ocurrió tanto para las citoquinas Th1 como para las Th2. Estos resultados muestran un promedio de tres experimentos efectuados bajo el mismo modelo y en forma separada.

FIGURA 4. producción de citoquinas en células esplénicas, provenientes de animales tratados o no con diferentes dosis del compuesto HB 001, e inmunizados con bacteria de Brucella abortus y cultivados in vitro por 24 horas con medio RPMI ( ) o en presencia de proteína total de brucela 10 μg/ml ( ). IFN-γ, IL-2 e IL-4 son mostradas en los gráficos A, B y C respectivamente, donde cada barra representa el promedio de tres experimentos con su desviación estándar.


4.4- Efecto del tratamiento con HB 001 en la producción de citoquinas de células de bazo provenientes de animales inmunizados con vacuna de Brucella abortus y cultivados con bacteria completa.


En este caso , siguiendo el mismo protocolo de inmunización del punto anterior , las células esplénicas obtenidas de los distintos grupos de ratones fueron cultivadas por 24 horas en presencia de la bacteria muerta, en una cantidad de 108 y 106 células de brucela por ml, además de un grupo control incubado solo con RPMI. Como se evidencia en la figura 4, cuando se utiliza este tipo de inmunoestimulante "in vitro", se obtiene un claro incremento en la liberación de citoquinas tipo Th1: IFN-γ e IL-2 de los grupos que fueron inyectados con el compuesto respecto del control; situación que no ocurre para las citoquinas tipo Th2 en este caso para IL-4, en que se puede observar que los grupos de animales que recibieron tratamiento no sufren ninguna modificación respecto del grupo control. Aquí se muestran los gráficos con datos que representan el promedio de dos experimentos.

FIGURA 5. producción de citoquinas por células esplénicas provenientes de animales tratados o no con HB 001, inmunizados con cepa de Brucella abortus RB-51, que fueron cultivadas por 24 horas solo en RPMI completo ( ) o en presencia de la bacteria usada para inmunizar, a las concentraciones de 108 células por ml ( ) y 106 células por ml ( ). La producción de IFN-γ, IL-2 e IL-4 en los diferentes cultivos se muestran en los gráficos A, B y C respectivamente. Cada barra representa el promedio de dos experimentos y su correspondientes desviaciones estándares.


4.5- Producción espontánea de citoquinas en células de nódulos popliteos de ratones tratados o no con diferentes dosis de HB 001.


En este caso los distintos grupos de animales experimentales de cuatro ratones cada uno, fueron inyectados vía intraperitoneal por seis días consecutivos con las mismas concentraciones establecidas para todos los experimentos; al séptimo día todos los animales fueron inyectados en sus cojinetes plantares posteriores, con 2 μl de proteína total de brucela a una concentración de 500 μg por ml. Siete días después los animales fueron sacrificados, se extrajeron sus nódulos popliteos, y los linfocitos obtenidos de estos, fueron incubados sin estímulo adicional en RPMI 1640 por 24 horas. Como puede observarse en la figura 6 utilizando este modelo, se aprecia un aumento en la producción de IFN-γ en los grupos experimentales tratados con el compuesto comparados con el control tratado con el solvente. Paralelamente no se observa ninguna modificación para IL-2. en el caso de las citoquinas Th2, el IL-4 no sufre ningún efecto en los distintos grupos estudiados, sin embargo el IL-10 experimenta un claro aumento en el grupo de animales que fue tratado con la concentración mas alta de HB 001. Los resultados para IFN-γ, IL-2, IL-4 mostrados en las figuras A, B y C respectivamente, corresponden a un promedio de cuatro experimentos hechos bajo iguales condiciones. En el caso de IL-10, estos datos corresponden a un solo experimento.

FIGURA 6. producción espontánea de citoquinas por células de nódulos linfáticos provenientes de animales tratados con HB 001 e inmunizados con proteína total de brucela, cultivadas por 24 horas en medio RPMI. Las citoquinas IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 se muestran en las figuras A, B, C y D respectivamente. Cada barra de los gráficos A, B y C corresponden a un promedio de cuatro experimentos con su desviación estándar. En el caso del gráfico D, cada barra representa un único experimento.


4.6- Efecto del tratamiento con HB 001, en la producción de citoquinas de células de nódulos popliteos de ratones inyectados y estimulados “in vitro” con proteina total de Brucella abortus.


Para este caso se siguió la misma metódica de inmunización del punto anterior. Una vez obtenidas las células de los nódulos popliteos de los distintos grupos experimentales, estas fueron estimuladas “in vitro “con proteína total de brucela en una concentración de 10 μg/ml e incubadas por 24 horas junto a un control sin el antígeno. Los resultados obtenidos que se muestran en la figura 7 corresponden a un promedio de tres experimentos realizados en las mismas condiciones. En estos se puede apreciar que en el caso de IFN-γ hay un aumento en la producción de esta citoquina en los grupos experimentales respecto del control. En cuanto a IL-2 esta citoquina no sufre ninguna alteración. Para el caso de las citoquinas Th2, se puede observar que para IL-4, HB 001 no produjo ningún efecto y por último para IL-10 se aprecia un aumento en la producción de esta interleuquina, en los grupos inyectados con el compuesto estudiado comparados con el grupo control.

FIGURA 7. producción de citoquinas por células de nódulos popliteos, provenientes de animales tratados con el compuesto HB 001, inmunizadas y estimuladas en medio completo ( ) o en presencia de proteína total de Brucella abortus ( 10 μg/ml). IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10 son mostradas en la figuras A, B, C y D respectivamente. Cada una de las barras representa el promedio de tres experimentos con su correspondiente desviación estándar.


5. DISCUSION


Los resultados acá presentados, permiten afirmar que el compuesto HB 001 administrado a animales experimentales induce una mayor producción de IFN-γ e IL-2 en la mayoría de los casos, en otras palabras potencia la producción de citoquinas del tipo Th1 y por tanto es factible pensar que aumenta la respuesta inmune celular. Este efecto potenciador de HB 001 no se evidenció para IL-4 en los experimentos realizados, de esto se puede decir, que siendo esta interleuquina una de las principales citoquinas Th2, esta subpoblación de células T helper no se ve afectada por el compuesto en estudio. Los resultados obtenidos en los diferentes experimentos cuando se determinó IL-10, otra de las citoquinas Th2 son un tanto contradictorios y esto no es de extrañar, puesto que IL-10 fue primero reconocido por su capacidad para inhibir la activación y función efectora de células T, por lo que fue descrita como Factor Inhibitorio en la Síntesis de Citoquinas ( Fiorentino et al, 1989). Al encontrarse muy aumentada la actividad de las células efectoras de la respuesta inmune celular se puede plantear la hipótesis de que como mecanismo de regulación podría generarse una mayor producción de IL-10 .

En todos los diseños experimentales usados en el presente trabajo, se mantuvo el esquema básico de grupos de ratones tratados “in vivo” con HB 001, sus células esplénicas o de nódulos linfáticos obtenidas en forma estéril, incubadas por 24 horas ya sea solas o en presencia de algún estimulante, sea éste mitógeno o antígeno. En determinados casos, los animales de experimentación fueron inmunizados después del tratamiento con HB 001 y sacrificados a diferentes tiempos, posterior a la administración del antígeno.

La interpretación de los resultados en general tiene algo de dificultad por la variabilidad entre experimentos. Estos fueron expresados como promedio de los distintos experimentos realizados bajo las mismas condiciones con su respectiva desviación estándar. A estos se les realizó un análisis estadístico para poder observar si la diferencia entre los grupos experimentales y el control eran significativas o no. Este análisis se hizo mediante el método de Kruskall-Wallis y el test de comparaciones múltiples, que permite comparar todos los datos entre sí, y de esta forma tener resultados reales, para sacar las conclusiones correspondientes.

Si los resultados se analizan citoquina por citoquina, se puede apreciar que en la mayoría de los casos HB 001 induce una mayor producción de IFN-γ. La producción de IFN-γ conlleva un aumento de la citotoxicidad de TNF (Trinchieri y Perussia, 1985) y expresión en diferentes tejidos que son su blanco de MHC clase I y II (Wong et al, 1983; Gerrard et al, 1988). Al analizar el IL-2, se observa que para esta citoquina los resultados son más variables ya que en algunos casos se observa un aumento y en otros solo se ve una tendencia o simplemente no se aprecia efecto del principio activo en la producción de este factor de crecimiento para linfocitos T. En contraposición a este efecto positivo de HB 001 sobre las citoquinas tipo Th1 antes mencionadas, esto no se manifiesta para IL-4, principal activador de la respuesta inmune humoral, en que no se evidencia efecto en su producción. En el caso de IL-10 esta citoquina es la más variable en cuanto a su producción en las diversas situaciones analizadas. Los resultados obtenidos muestran una disminución de la producción de esta citoquina en los análisis hechos con células esplénicas, en cambio, para aquellos experimentos en que se estudiaron las células de nódulos linfáticos, los resultados muestran un aumento en la producción de esta citoquina. Al respecto y como se mencionó anteriormente por ser esta interleuquina una citoquina supresora de las células Th1, este aumento podría explicarse por la regulación cruzada que es sabido que existe entre las células Th1 y Th2, en que por ejemplo el IFN-γ inhibe la proliferación de las células Th2 (Gajewski et al, 1989), y a su vez éstas citoquinas, en especial IL-10 inhiben la producción de citoquinas Th1; por lo tanto estos resultados ratifican la existencia de un mecanismo de regulación negativo entre citoquinas del tipo Th1 y Th2 y viceversa, lo que hace que cuando se genera una respuesta inmune de tipo celular exagerada, que como hemos dicho ocurre por activación de las células Th1, las células Th2 en especial IL-10 se secretaría para disminuirla.

Estos resultados están en total concordancia con otros obtenidos en el laboratorio y que no fueron mostrados en este trabajo, estos demuestran que el compuesto HB 001 induce un aumento en las pruebas de transformación blástica lo que se correlaciona positivamente con un aumento de la respuesta inmune celular dependendiente de citoquinas Th1 (Flesch y Kaufmann, 1989). Adicionalmente, la administración del compuesto en estudio generó un efecto nulo o una disminución en la producción de anticuerpos, es decir, de la respuesta inmune humoral que depende de las citoquinas tipo Th2 (Whalen et al, 1988). Esta inhibición se explica por la acción de IFN- y, que actúa produciendo calcitrol, la cual además de ser responsable de la activación de los macrófagos es responsable de la inhibición de las células Th2 (Hsieh et al, 1993; Seder et al, 1993)

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ANEXOS

SOLUCIONES UTILIZADAS EN MATERIALES Y METODOS

1.- BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) pH 7.0:

para 1000 ml:

NaCl 80,0 grs.

Na2HPO4 11,6 grs.

KH2PO4 2,0 grs.

KCl 2,0 grs.

H2O c.s.p. 1000 ml.

Ajustar a pH 7,0 con NaOH 5 M o HCl 2N. Guardar a 4º C.

Esta solución debe usarse dentro de tres días después de preparada.

2.- BUFFER CARBONATO 0,1 M pH 9,5

para 1000 ml:

NaHCo3 8,40 grs.

Na2CO3 3,56 grs.

H2O c.s.p. 1000 ml.

Ajustar a pH 9,5 con NaOH 5M o HCl 2N. Guardar a 4ºC

Esta solución debe usarse dentro de siete días después de su preparación

3.- MEDIO COMPLETO RPMI 1640

para 100 ml:

1 ml piruvato de sodio 100 x estéril

1 ml Pen-Strep 100 x estéril

1 ml Anfotericina B 100 x estéril

1 ml 2-mercaptoetanol 100x estéril

10 ml suero bovino fetal (SBF) estéril

86 ml RPMI 1640 incompleto estéril

Almacenar a 4ºC hasta seis semanas después de su preparación.

4.- SOLUCION BLOQUEO

para 100 ml:

Leche descremada 5% 5 grs.

PBS 10 x 10 ml.

H2O c.s.p. 100 ml.

5.- SOLUCION LAVADO

para 1000 ml:

Tween 20 0,05% 0,5 ml.

PBS 10 x 100 ml.

H2O c.s.p. 1000 ml.

6.- SOLUCION REVELADORA

para 100 ml:

TMB 0,4 g/l 50 ml.

H2O2 0,02 % 50 ml.



Preparar en el momento de utilizar. El kit de solución reveladora es estable por un año a 4°C. Es altamente inestable a la luz.



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