Detección de Salmonella spp. Mediante pcr en Muestras de Embutidos, Cereales y Superficies Inertes



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ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL
Facultad de Ingeniería en Mecánica y Ciencias de la Producción
“Detección de Salmonella spp. Mediante PCR en Muestras de Embutidos, Cereales y Superficies Inertes”


TESIS DE GRADO
Previo a la obtención del Título de:

INGENIEROS DE ALIMENTOS
Presentada por:

Ian Fabricio Armendáriz Toral

Pierina Elizabeth Barreiro Zambrano
GUAYAQUIL - ECUADOR

AÑO: 2013



AGRADECIMIENTO

Al Departamento de Biología Molecular del Centro de Investigaciones Biotecnológicas del Ecuador (CIBE), por permitirnos utilizar sus instalaciones, en especial al PhD. Efrén Santos por su guía y dedicación.

Al personal de Laboratorios PROTAL-ESPOL, por su esmero en la realización de proyecto y su gran acogida. En especial a la Dra. Gloria Bajaña por su paciencia y esfuerzo.

Ian Armendáriz

AGRADECIMIENTO

A la PhD. Esther Peralta, directora del CIBE, por darnos la oportunidad de desarrollar este tema. En especial PhD. Efren Santos y también a todo su equipo por brindarnos su apoyo para el desarrollo de este proyecto.

A la Dra. Gloria Bajaña por su confianza y por abrirnos las puertas de los Laboratorios de Protal para alcanzar nuestro objetivo. A la Dra. Mónica por su dedicación y perseverancia.

Pierina Barreiro

DEDICATORIA

A MIS PADRES: Hugo y Gloria, ellos son quienes me han motivado a llegar hasta acá, esto es para ellos.



Ian Armendáriz

DEDICATORIA

A DIOS quién, con su bendición, me ha permitido llegar hasta aquí.

A MIS PADRES Remberto Y Lorena por confiar en mí, por ser mis héroes y esforzarse con dedicación y entrega para que siempre estemos bien. Son ellos quienes han hecho de mí la persona que soy y les debo estar aquí conquistando una nueva meta.

A MI FAMILIA Y HERMANOS por darme todo su amor, apoyo y cariño a lo largo de mi vida.

A Manuel por motivarme a seguir adelante.

A MIS AMIGOS con quienes he compartido estos últimos años llenos de altos y bajos, noches de estudio, viajes, y un sinnúmero de anécdotas.



Pierina Barreiro

TRIBUNAL DE GRADUACIÓN

_____________________ ____________________


Dr. Kléber Barcia V., PhD. PhD. Efrén Santos O.

DECANO DE LA FIMCP DIRECTOR DE TESIS

PRESIDENTE

____________________


Ing. Priscila Castillo S.

VOCAL


DECLARACIÓN EXPRESA

“La responsabilidad del contenido de esta Tesis de Grado, nos corresponde exclusivamente; y el patrimonio intelectual de la misma a la ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DEL LITORAL”.


(Reglamento de Graduación de la ESPOL)

________________________ ____________________________

Ian Fabricio Armendáriz T. Pierina Elizabeth Barreiro Z.


RESUMEN

El avance de la biotecnología ha permitido el desarrollo de técnicas moleculares para el estudio del genoma de la salmonela. El objetivo de este trabajo fue validar la detección de Salmonella spp. en muestras de interés para la industria alimentaria mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) en comparación con la metodología tradicional (Salmonella en Alimentos. Método Oficial 967.26; AOAC).


Se evaluaron tres matrices de muestras: superficies inertes, cereales y embutidos con dos parejas de iniciadores en el PCR; cada matriz constó de 10 muestras y cada muestra se analizó por triplicado (muestra inoculada con un control positivo, un control negativo y sin inocular) para posteriormente realizar los análisis estadísticos, económicos y protocolares pertinentes.
Como resultado de los análisis realizados se tuvo que en Superficies 33 de las muestras dieron positivo y 67 negativo, en Cereales 28 dieron positivo, 67 negativo y 5 Falsos Negativos, por último en Embutidos se obtuvo 67 negativos, 25 positivos y 8 falsos positivos. Estos resultados demostraron que hay concordancia entre los métodos Tradicional y PCR, siendo ambas técnicas eficientes para la detección de Salmonella spp. en las muestras analizadas.
Se validó estadísticamente la concordancia de resultados del procedimiento de detección de Salmonella spp. molecular y microbiológico, logrando identificar restricciones en el análisis y descartando amplificaciones de fragmentos genéticos no deseados.


ÍNDICE GENERAL

Pág.


RESUMEN 9

ÍNDICE GENERAL 11

ABREVIATURAS 11

ÍNDICE DE FIGURAS 13

ÍNDICE DE TABLAS 14

INTRODUCCIÓN 15

1.1. Antecedentes 17

1.2. Género salmonella 21

Salmonelosis 31

1.3. Epidemiología 33

1.4. Técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 34

Principios de la Técnica 36

1.5. Descripción del ADN 60

1.6. Métodos tradicional y no tradicional para la detección de Salmonella spp. en la industria de alimentos 68

68

2.1. OBJETIVOS 90



2.2. HIPÓTESIS Y JUSTIFICACIÓN 91

3.1. Población muestral 93

3.2. Descripción de las cepas 94

3.3. Materiales y metodología 95

3.4. Análisis estadístico 107

3.5. Validación 113

4.1. Análisis estadístico comparativo del método PCR y tradicional 114

4.2. Estimación de tiempos y costos 125

4.3. Discusión 129

Bibliografía 139





ABREVIATURAS


spp.: Especies



et al.: Colaboradores

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

ADN: Ácido Desoxirribonucleico

ARN: Ácido Ribonucleico

H: horas

Min: Minutos

Seg: Segundos

Ec.: Ecuación

pH: Potencial de hidrógeno

UV: Ultravioleta

ATTC: American Type Culture Collection

ETA: Enfermedades transmitidas por alimentos

EDA Enfermedades diarreicas agudas

EDTA: Etilendiaminotetracético

cADN: ADN complementario

ARNm: ARN mensajero

A: Adenina

T: Timina

G: Guanina

C: Citosina

TAE: Tris-Acetato-EDTA

°C: Grados Celsius

bp: Pares de bases

µm: Micrómetros

µl: Microlitros

µg: Microgramos

ml: Mililitros

mm: Milímetros

KCl: Cloruro de Potasio

MgCl2: Cloruro de Magnesio

K: Índice de Kappa

Po: Proporción de concordancia observada

Pe: Proporción de concordancia esperada

n: Número de muestras

PR: Precisión relativa

SR: Sensibilidad relativa

ER: Especificidad relativa

AP: Acuerdos positivos

AN: Acuerdos negativos

VP: Verdaderos positivos

FP: Falsos positivos

FN: Falsos negativos





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