Desarrollo y evaluación de una vacuna antimastitica con adyuvante oleoso



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DESARROLLO Y EVALUACIÓN DE UNA VACUNA ANTIMASTITICA CON ADYUVANTE OLEOSO”

CODIGO OGITT: 2-02-06-02-040

Benigno Tintaya Félix1, Arturo Rosales Fernández1



1Centro Nacional de Productos Biológicos, Instituto Nacional de Salud.
RESUMEN

Objetivo: Evaluar la eficacia de una vacuna con adyuvante oleoso, elaborada a partir de las bacterias prevalentes en las cuencas lecheras de Lima y Arequipa; en el control de la mastitis. Materiales y Método: Se inoculó la bacterina a 116 vaquillas y/o vacas en periodo de seca, manteniéndose un grupo de 104 animales control. La primera vacuna 60 días antes del parto, 30 días posteriores al parto la segunda y una tercera vacuna 90 días después de la segunda vacuna; con dosis de 3mL por vía intramuscular profunda en el anca del animal. Previamente a cada vacunación se les realizó la prueba California Mastitis Test, adicionalmente una cuarta y última prueba a los 30 días con el objeto de evaluar la presencia de mastitis subclínica. Resultados: La inmunización disminuyó los casos de mastitis, señalando ser un factor protector (0.716*) y el no estar vacunado el riesgo de enfermar es de (5.416*). Conclusiones: El estudio demuestra la eficacia de este tipo de vacuna considerándosela de gran utilidad en la prevención de la mastitis; ya que esta enfermedad es un problema de carácter poblacional y multifactorial imposible de erradicar; por consiguiente, su control depende de la aplicación de un sistema integral de medidas.

Palabras claves: Mastitis bovina / inmunización, Vacuna con adyuvante oleoso, Eficacia (fuente: BIREME)



ABSTRACT

Objective: To evaluate the efficiency of a mastitis vaccine elaborated from the prevalent bacteria present in the dairy basins from Lima and Arequipa.

Method: 116 cows were inoculated i.m. with 3 ml of vaccine. The first dose was given 60 days before calf birth, the second dose was given 30 days after calf birth the first one and the last one 90 days after the second dose. 104 cows were considered as control animals. California mastitis test was always performed before each vaccine dose and a last test was performed 30 days after the last vaccine dose to evaluate the presence of subclinical mastitis.

Results: Vaccination demonstrated to be a protective factor (0.716*) ; non vaccinated animals were in risk of sickness (5.416*).

Conclusions: The study demonstrated the efficacy of the vaccine in preventing mastitis.

KEY WORDS: Bovine mastitis / immunization, oily adjuvant vaccine, efficacy. (source: BIREME)


INTRODUCCIÓN

La mastitis, o inflamación de la glándula mamaria, es la enfermedad más común y costosa del ganado lechero en la mayor parte del mundo, producida generalmente por bacterias de los géneros Streptococcus, Staphylococcus y bacterias coliformes.

La mastitis clínica como la mastitis subclínica llevan a una severa disminución en la producción y calidad de la leche generando pérdidas económicas apreciables, las pérdidas por mastitis son el doble de altas que las pérdidas por infertilidad y problemas de reproducción. Mucho más leche se pierde por mastitis subclínicas debido a que: la gran mayoría de los casos son subclínicos (en promedio, por cada caso clínico, existen de 20 a 40 subclínicos). La mayor parte de los casos clínicos comienzan como subclínicos; por lo tanto, el controlar los casos de mastitis subclínica es la mejor forma de reducir los casos clínicos. (4)
Los cambios en la composición de la leche (reducción de calcio, fósforo, proteína y grasa, e incrementos de cloro y sodio) disminuyen su calidad (4). Además, los antibióticos utilizados en el tratamiento de la mastitis son una preocupación industrial y de salud pública importante. La presencia de residuos de antibióticos en la leche interfiere con el proceso de fabricación de muchos productos lácteos (quesos y otros productos fermentados). Los sabores indeseables reducen el valor de los productos lácteos y la presencia de bajos niveles de antibióticos conllevan a la aparición de bacterias resistentes y/o de hipersensibilidad en el humano,(9) causando problemas de salud a los consumidores; así como interferencias en los proceso de fabricación de muchos productos lácteos. (4)(6).
Streptococcus agalactiae

El Streptococcus agalactiae es la causa más común de infecciones subclínicas pero muy rara vez produce una severa enfermedad (mastitis aguda). Este organismo vive en la ubre de la vaca y sobrevive solamente un corto período de tiempo por fuera de la glándula mamaria. (12)



Staphylococcus aureus

El Staphylococcus aureus vive dentro o fuera de la ubre, en la piel del pezón y puede causar tanto mastitis clínica como subclínica. Generalmente se disemina de la misma forma que el Streptococcus agalactiae. (12)


Streptococcus uberis y Streptococcus dysgalactiae

Estos organismos se encuentran en la cama (especialmente camas orgánicas: paja, aserrín, etc.), aguas estancadas y tierra. Pueden encontrarse también en la piel de la vaca (pezón y abdomen) y en los órganos reproductores. Estos organismos son generalmente transferidos desde el medio ambiente al pezón entre los ordeños, pero algunas transferencias pueden tener lugar durante el ordeño. Estos organismos no pueden ser eliminados del hato debido a que son parte normal del medio ambiente. (12)



Bacterias coliformes

Las bacterias coliformes son habitantes normales del suelo e intestino de las vacas. Se acumulan y multiplican en la materia fecal y en la cama. Los coliformes pueden causar mastitis solamente si las partículas contaminadas del medio ambiente entran en contacto con la ubre. A diferencia de las bacterias descritas previamente, los coliformes no se adhieren a los conductos y al alvéolo de la ubre, en lugar se multiplican rápidamente en la leche y producen toxinas que son absorbidas dentro del torrente circulatorio. Como resultado, las infecciones por coliformes conducen a mastitis clínicas agudas. (12)

El propósito del presente trabajo fue elaborar una vacuna basada en las principales cepas nativas de la cuenca lechera de Lima y Cañete; y demostrar, mediante vacunación la eficacia de la vacuna en vacas de Lima y Arequipa. Los resultados de este estudio serán útiles para la prevención y el control sanitario de la mastitis en el ganado productor de leche.
MATERIALES Y METODO

PREPARACION DE LA BACTERINA

Los antígenos empleados se obtuvieron de aislamientos en muestras positivas de leche de vacas de los valles de Lima y Cañete con mastitis clínica. El aislamiento y la identificación inicial de las bacterias fueron realizados con las técnicas bacteriológicas convencionales. (13)(14)(15).

Cada uno de los cultivos fueron sometidos a un crecimiento en masa y preparación de la suspensión bacteriana a una concentración celular de 109-1010 ufc por mL en medios TSA. En la inactivación se empleo formaldehído al 0,5%, en el volumen de la suspensión bacteriana, incubado a 26°C por 72 horas y con agitación permanente. Finalmente en la formulación antigénica de la vacuna (fase acuosa), se incluyen en un 30% cada una de las especies prevalentes en el área de estudio (E.coli, Estaphylococcus aureus, Estreptoccocus agalactiae) y el 10% restante por otras bacterias aisladas (Corinebacterium y Micrococcus).El cual fue sometido a un proceso de emulsión en la proporción 60:40 (V/V), antígeno / óleo (Montanide ISA 50) (16) un adyuvante oleoso que le permite una liberación más lenta de los antígenos y por lo tanto una mayor y sostenida respuesta inmune que otras vacunas, ofreciendo mayor tiempo de protección.


Controles.-

En la vacuna terminada, los controles fueron: prueba de la gota, mantenimiento de la emulsión por centrifugación; conductividad, esterilidad, inocuidad, toxicidad y estabilidad. (17).


TEST CMT

La Prueba California de Mastitis

La prueba CMT (California Mastitis Test) se realizó para la detección rápida de mastitis subclínica en cada uno de los cuartos de la vaca lechera, basada en la detección de incrementos en el número de células somáticas en la leche (leucocitos + células epiteliales) y modificaciones en el pH de la misma. Se tomaron aproximadamente 2 mL de leche de cada cuarto en una raqueta de CMT limpia, (marcados A,B,C y D) se agregó igual volumen de solución CMT a cada compartimiento; se rotó la raqueta con movimientos circulares hasta mezclar totalmente el contenido. La reacción recibió una calificación visual. Entre más gel se forme, mayor es la calificación. (18)(19)


VACUNACIÓN DE LAS VACAS

El tamaño de muestra calculado fue de 220 animales. Para el estudio se designó 2 grupos de vacas. Un grupo (116 vaquillas y/o vacas en periodo de seca) fue vacunado; y el otro grupo (104) fue designado como grupo control.

La inoculación de la vacuna se realizó con dosis de 3mL por vía intramuscular profunda en el anca del animal. La primera 60 días antes del parto, 30 días posteriores al parto la segunda y una tercera 90 días después; Previamente a cada vacunación se les realizó la prueba de California de Mastitis, y una cuarta adicional a los 30 días.

Se emplearon vaquillas en primer parto, y vacas dado que muchas infecciones detectadas en etapas de pre-parto pueden impactar negativamente en el desarrollo mamario y persistir durante la lactancia subsiguiente, esto reduce la producción de leche. El grupo control o testigo, fueron animales (vacas o vaquillas) escogidas al azar del grupo de animales.


ANALISIS DE LOS RESULTADOS

Para el análisis de datos se utilizó el paquete estadístico SPSS. Incidencia y Riesgo Relativo (R.R.) para diferentes períodos y localidades.


RESULTADOS

Se compararon las características de Incidencia entre los grupos de animales vacunados y testigo, Tabla Nº 1; encontrándose que los testigo se presentaron en un porcentaje mayor. Así mismo la Incidencia según localidad Tabla Nº 2, también es mayor en los testigo, con porcentajes mayores para la localidad de Arequipa.



Tabla 1. Incidencia de Mastitis en diferentes periodos. Datos generales





CMT 1

CMT 2

CMT 3

CMT 4

Testigo

0.0

(0/104)


23.1

(24/104)


24.0

(25/104)


32.4

(34/104)


Vacunado

0.0

(0/116)


5.2

(6/116)


5.2

(6/116)


6.0

(7/116)



Tabla 2. Incidencia de Mastitis en diferentes periodos. Resultados según localidad.

Localidad

Grupo

CMT 1

CMT 2

CMT 3

CMT 4

Arequipa

Testigo

0.0

(0/79)


27.8

(22/79)


27.8

(22/79)


39.2

(31/79)


Vacunado

0.0

(0/79)


4.8

(4/84)


4.8

(4/84)


6.0

(5/84)


Lima

Testigo

0.0

(0/25)


8.1

(2/25)


12.0

(3/25)


12.0

(3/25)


Vacunado

0.0

(0/32)


6.3

(2/32)


6.3

(2/32)


6.3

(2/32)


Hallando Riesgo Relativo de acuerdo a los datos de la Tabla 1, se puede observar que la vacuna es un factor protector (0.716*)y el no estar vacunado el riesgo de enfermar de mastitis es de (5.416*).




CMT 1

CMT 2

CMT 3

CMT 4

Testigo

-

4.432*

(1.898-10.486)



4.647*

(1.985-10.882)



5.416*

(2.510-11.692)



Vacunado

-

0.811*

(0.724-0.909)



0.801*

(0.743-0.900)



0.716*

(0.622-0.825)



* p < 0.0001
El Riesgo Relativo de acuerdo a los datos de la Tabla 2, indica que la condición de vacunado es un factor protector contra la mastitis para el grupo de Arequipa y en cuanto a Lima no es concluyente.

Localidad

Grupo

CMT 1

CMT 2

CMT 3

CMT 4

Lima

Testigo

-

1.28

(0.194-8.463)



1.92

(0.347-10.626)



1.92

(0.347-10.626)



Vacunado

-

0.981

(0.848-1.136)



0.939

(0.792-1.113)



0.939

(0.792-1.113)



Arequipa

Testigo

-

5.848*

(2.109-16.22)



5.848*

(2.109-16.22)



6.592*

(2.698-16.105)



Vacunado

-

0.758*

(0.655-0.876)



0.758*

(0.655-0.876)



0.646*

(0.537-0.777)




DISCUSIÓN

La capacidad protectiva de la vacuna elaborada a base de las especies prevalentes en las áreas de estudio (E. coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae y otras como Corinebacterium y Micrococcus), con adyuvante oleoso se demuestra por la menor incidencia en el grupo vacunado (6.0%) en relación con los animales no vacunados que desarrollaron mastitis (32.4%).

Sin embargo, cuando se analiza el Riesgo Relativo (R.R.), éste indica que la vacuna es un factor de protección en el grupo vacunado, con respecto al testigo en el General. Con respecto a la localidad, el que corresponde a Lima, no se podría concluir que el no estar vacunado los animales correrían el riesgo de contraer mastitis.
Los resultados de esta evaluación, si comprueba las ventajas que ofrece la vacuna para el control de la enfermedad, aplicándose en las condiciones de explotación en el campo.
La aplicación sin embargo debe ser completada con medidas de manejo, aplicar una rutina de ordeño higiénica, usar y mantener de manera adecuada el equipo de ordeño, dar tratamiento a la piel de la ubre y pezones, aplicar exámenes a las vacas que se deseen introducir a la explotación, llevar un registro de datos sobre el estado de salud de las hembras, conservar un ambiente limpio y emplear un esquema de vacunación para prevenir la enfermedad. (20)
Las vacunas desarrolladas contra la mastitis no han tenido mucho éxito en el pasado. Hace varias décadas se elaboró un toxoide a base de Staphylococcus aureus para inmunizar las vacas contra mastitis causadas por este germen, pero lamentablemente tuvo poco éxito. Hasta hace poco, la única vacuna que ha demostrado un éxito razonable ha sido la J-5 (basada en una mutante de E. Coli) en el control de mastitis aguda causada por coliformes (E.coli, Klebsiella, Enterobacter y Serratia), con un 70 a 80% de reducción en la casuística clínica, siguiendo un programa de 3 vacunaciones: (60 y 30 días antes del parto, y al parto). La mutante J-5 posee algunos carbohidratos que pueden causar algunos efectos indeseables en los animales vacunados.

Una bacterina (Endovac-bovi) que utiliza la mutante R/17 de Salmonella typhimurum libre de carbohidratos produce anticuerpos que ofrecen protección cruzada contra S. Typhimurum, Pasteurella spp y E. Coli, así como anticuerpos opsonizantes que estimulan la fagocitosis. Es utilizada contra la mastitis por coliformes. La Endovac-bovi es potenciada mediante un adyuvante.

En los últimos años se descubrió que el Staphylococcus aureus, al infectar la ubre formaba una seudo-cápsula o microcápsula a base de exopolisacáridos que interfería con la fagocitosis. Esta seudo-cápsula no se forma en los cultivos in vitro.

Se han desarrollado métodos para elevar la respuesta inmunogénica de los exopolisacáridos que de por sí es muy débil y protege al germen de los mecanismos de defensa de la ubre. Esta es la base para las nuevas vacunas contra mastitis por Staphylococcus aureus, que resultan en la opsonización y fagocitosis de las bacterias. Sin embargo, aun esta por resolverse la identificación de todos los serotipos capsulares causantes de la mastitis para la elaboración de vacunas más efectivas.

En estas vacunas, como en muchas otras hay que destacar el rol de los adyuvantes liposomales formados a base de colesterol y fosfolípidos que favorecen la fagocitosis.

En Canadá se esta desarrollando una vacuna contra Streptococcus agalactiae que promete tener buenos resultados. (21)


CONCLUSIONES

Se concluye que, bajo las condiciones de estudio, los animales vacunados manifestaron protección contra la mastitis; mejorando por lo tanto los niveles de producción láctea en beneficio del productor. Sin embargo se hace necesario recalcar que las medidas para controlar la mastitis consisten en: aplicar una rutina de ordeña higiénica, usar y mantener de manera adecuada el equipo ordeña, dar tratamiento a la piel de la ubre y pezones, aplicar exámenes a las vacas que se deseen introducir a la explotación, llevar un registro de datos sobre el estado de salud de las hembras, conservar un ambiente limpio y emplear un esquema de vacunación para prevenir la enfermedad.


REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Blood DC & Radostits O M. Medicina Veterinaria 7a ed. Mexico: Editorial Interamericana; 1992

2. Freeman BA. Tratado de Microbiología de Burrows 21va ed. Mexico: Editorial Interamericana; 1983.

3. Jawetz D, Melnick. J y Adelberg E. Microbiología médica. 14va ed. Mexico: Editorial El Manual Moderno SA; 1992.

4. Philpot,Nelson. Manejo de la mastitis. Illinois: Babson Bros. Co; 1978.

5. Francois S, Meregalli S, Sutich. E. Mastitis bovina: tipificación de cocos Gram positivos y determinación de su sensibilidad a quimioterápicos. [en línea], [fecha de acceso 10 de Octubre de 2001]. URL disponible en: http://www.e-campo.com/media/news/nl/lech tambo sanidad 25.htm

6. Aguado Solís J A. Características de los diferentes agentes etiológicos causantes de mastitis bovina. Ponencia en: III Congreso Nacional de Control de Mastitis y Calidad de la Leche. León, Gto. Mexico; Junio 2001

7.Wolter W, Castañeda V H, Kloppert B Y Zschoeck M. La mastitis Bovina. Instituto Estatal de Investigaciones de Hesse. Universidad de Guadalajara. México: [2002]

8.Agrobit Mastitis: Enfermedad y Trasmisión. [en línea] Córdova, 28 de Mayo de 2003 URL disponible en:

http://www.agrobit.com.ar/Info_tecnica/Ganaderia/enfermedades/GA000009en.htm

9.Bermúdez Víctor. La Sanidad animal y la producción lechera en Venezuela. Caracas, [2002]

10.Prado Flores G, Carabias Martínez, Rodríguez Gonzalo E, Herrero Hernández E. Presencia de residuos y contaminantes en leche Humana. Rev. Esp Salud Pública. 2002; 76(2): 133-147.

11.Philpot, W.N. y Nickerson, S.C. 1992. Mastitis: el contra ataque. Louisiana, E.U.A. Babson Brothers Co. 147 p.

12.Agrobit Mastitis: Enfermedad y Trasmisión. [en línea] Córdova, 28 de Mayo de 2003 URL disponible en:

http://www.agrobit.com.ar/Info_tecnica/Ganaderia/enfermedades/GA000009en.htm

13.La leche. En: Manual para toma y envío de muestras al Laboratorio. [en línea]. URL disponible en: http://www.iicasaninet.net/pub/sanani/html/muestras/leche.html

14.Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos bacteriológicos en infecciones intra hospitalarias. Lima:INS;201. Serie de Normas Técnicas 28.

15.LIFEX. Toma y envío de muestras al Laboratorio, manual de procedimientos Salud Animal [en línea]. [fecha de acceso 26 de Setiembre de 2003].URL disponible en: http://www.laboratorios life.com/lifex.htm

16.SEPPIC. Compatibility of montanide with packaging. [Enero 1985]

17.Abaracón D. Manual didáctico sobre producción, control de calidad y uso de vacuna con adyuvante oleoso contra la fiebre Aftosa. Brasil; OPS 1983.

18.Ferraro L, Scaramelli A y Troya H. Prevalencia de la mastitis subclínica bovina en Venezuela y Evaluación de la prueba de Mastitis de California (CMT) como prueba diagnóstica. Rev. Cient Vet. [en línea] 1999 [fecha de acceso 29 de Setiembre de 2003]; 9 (2): URL disponible en: http:

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19.e-campo.com. En: Test Mastitis California (Método de Schlam): Estudio para mejorar su utilización frente a casos de variación de color en la mezcla leche-reactivo.[16 de Agosto 2003] [en línea]. [fecha de acceso 26 de Setiembre de 2003]. Disponible en: http://www.e-campo.com/sections/ne.../catUuid.91DOE816-E269-11D3-A5140006292E274

20.UNAM, EDITORIAL. Vacuna contra mastitis bovina. Mariela Salazar Hernández.. Las vacunas contra la mastitis, especialmente destaca la inmunización (fecha de acceso 15 de Enero de 204)URL disponible en :



http://www.cuautitlan2.unam.mx/comunidad/pdf-s/com10oct.pdf..

21.Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú UNMSM. Facultad de Medicina Veterinaria. ISSN versión electrónica 1609-9117. Vol.12, Nº 2, 2001. Mastitis: prevención y control Hans Andresen.






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