Cultivo del pijuayo



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Pollen collecting, handling and controlled pollination


Practical methods for pollen collecting, handling and controlled pollination are essential for breeding programmes and some seed production systems. Relatively simple methods, developed in Costa Rica, are briefly described below. The most difficult part is pollen collecting and pollination in tall trees.

Before collecting the pollen, one must predict when the inflorescence will open. The immature inflorescence has a nearly vertical orientation. In the Utilis landrace, the inflorescence assumes a more horizonal inclination 1 – 2 days before opening. In other landraces, this change in inclination occurs anywhere from 1 to 7 days or more before opening; therefore, it is a less valuable predictor.

There are three simple pollen – collecting methods, although the first is most practical.

Remove the inflorescence just before it opens. Cut it open lengthwise, remove the rachillae and spread them on kraft paper. Dry them in an oven at about 40ºC or in a handmade plant dryer using a light bulb as the eat source. Pollen will be released 24 hours after the inflorescence opens.

Remove the unopened inflorescence just before it opens. Quickly put the peduncle in a jar of water, and support the inflorescence on an open frame above a piece of kraft paper or aluminium foil. Male anthesis develops normally and pollen is released 24 hours after the bract opens.

Place a kraft paper bag around the inflorescence the day before it opens. To prevent the extremely small curculionid beetles from entering, place a cotton washer with insecticide in the mouth of the bag and seal the bag tightly. Remove the bag with pollen 2 days later. With this method, much of the pollen adheres to the paper and could be wasted; the can be oven – dried to recover some of this pollen. A greater potential problem may be the effect of male flower fermentation inside the bags before collecting and removing the pollen. Fermentation may begin during the night after flower abscission.

The collected pollen includes debris such as male flowers, anthers and trichome cells. The flowers and anthers can be screened out, leaving only the pollen and trichome cells. Only 50% or less of the material collected after screening is pollen; the larger, spherical, darker bodies are the trichome cells. This mixture can be diluted even more with talc for use in controlled pollination, but this is only recommended for every scarce and valuable pollen.

After collecting, pollen should be dried 24 – 48 hours with CaCl2 or silica gel, then refrigerated or frozen. Under these conditions, pollen should maintain about 40% viability for 6 months. Viability is easily tested by germination on simple media: on 2.5% sucrose or 5% glucose agar in a petri dish, or on a small square of cellophane floating on the solution. Pollen can also be germinated on filter paper moistened with a 2.5% sucrose or 5% glucose solution, but this method is more difficult in practice. The fibres of whit filter paper are similar in appearance to the pollen tubes, making it difficult to count germinated grains. Fresh pollen germinates in about 75 minutes on these media at room temperature (about 25ºC).

Controlled pollination will be most effective if done when female flowers anthesis begins, late in the afternoon on the first day of the flowering cycle. At this time, however, contamination by airborne and insect – dispersed pollen from other inflorescences is very likely. For these reasons, controlled pollination is recommended early the following morning when curculionids are inactive and there is little airborne pollen. Using a simple hand – held blower, the pollen is introduced through an opening in the protective bag is then carefully resealed. Bags can be removed the day following pollination.

Prior to controlled pollination, emasculation of male flowers is often considered to prevent self – pollen contamination, but this has serious disadvantages in peach palm. In theory, emasculation is not necessary, since male anthesis occurs late on the second day of the flowering cycle and by that time fertilization should have occurred if the controlled pollination was done properly; it is also possible to test the degree of self – sterility a year before, although nothing is yet known about the effects of the environment on the genetic self – sterility system. In practice, however, there is no guarantee of 100% crossing success, so some self – pollen contamination is possible. Emasculation is difficult, however, especially in tall trees.

It is also time consuming (30 – 45 minutes for one inflorescence), tends to block the pistil with tricomes which reduce pollination efficiency, and may stress the inflorescence so much that even successfully pollinated flowers may abscise. Selfing can be checked after germination by analyzing the isozyme or DNA profiles of the seedling progeny, if their parents have contrasting alleles at one or more loci; this is only justified, however, for very important crosses and probably cannot serve as a general practice at this time.


Posibilidades de la propagación vegetativa del pijuayo por cultivos de tejidos

Entre 1983 y1991, se realizaron alrededor de 14 estudios sobre multiplicación del pijuayo por cultivo de tejido; once de ellos, fueron intentos para producir plantas a partir de callos de ápices caulinares. Los otros propágulos ensayados fueron, en orden de importancia: secciones de hojas jóvenes (pre emergentes), flores inmaduras (secciones de raquilla o flores masculinas aisladas), y secciones de tallo (tejido subapical).

Por distintas vías, han ocurrido varios casos de conformación de plantas completas a partir de ápices procedentes de plántulas o hijuelos basales; sin embargo, estos procesos son por lo general difícilmente reproducibles. El ápice caulinar muestra, hasta hoy, la mayor capacidad de expresión morfogénica a través de dos vías promisorias; a) inducción de brotes laterales sin producción de callos y b) inducción de brotes o embrióides previa inducción de callos. En lo que respecta a la primera vía, falta lograr mayor control sobre la producción de brotes, su aislamiento y enraizamiento. Para su aplicación a mayor escala, la segunda vía deberá ser más inducible, principalmente en términos de producción de embrióides. El factor genético ha sido uno de los principales condicionantes, tanto sobre la posibilidad de establecimiento como sobre el potencial morfogénico de los propágulos.

Tipos de propágulos y factores en estudio de los experimentos conducidos


Experimento

Tipo de propágulo

Factores de estudio

1

Secciones de hojas

Secciones de tallo



Genotipo, tamaño de hijuelo, tipo de propágulo, y luz sobre la oxidación.

2

Secciones de tallo

Antioxidantes (cisteína, KNO3, ac. Ascórbico, tirosína y carbon activado CA y el tiempo de cultivo

3

Secciones de tallo

Antioxidante (cisteína y caseína) y el tiempo de cultivo

4

Apices

Antioxidante (cisteína y caseína), estado físico del medio y tiempo de cultivo

5

Apices

Antioxidante (caseína más CA) y tiempo de cultivo

6

Secciones de hoja

Fitoreguladores AIB, BA y 2,4 – D para incluir callos

7

ápices

Fitoreguladores ANA y Ba para inducir brotes.

Inducción de callos

Luego de los 16 días de cultivo en oscuridad, se observó el inicio de callos en las secciones de hoja. Esto ocurrió en dos tratamientos cuyas combinaciones de fitoreguladores fueron (en mg/L) 10 de ácido indolbutírico (AIB) mas de 5 de brenciladenina (BA) o 5 de AIB mas 30 de 2,4 – D. Estos callos no prosperaron al ser recultivados y la oxidación y contaminación fue crecientes. Luego de 15 semanas se descartaron los cultivos por alta contaminación. Stein (1988), al cultivar secciones de hojas, caracterizó un tipo de callo precoz con crecimiento limitado, sin tejido meristemático y formado por células grandes y deformadas. Esto explicaría la falta de organización y pérdida de vigor observada en los callos logrados en este estudio.



Inducción de brotes

Como continuación al trabajo iniciado por Pinedo (1987), se usaron varias introducciones de la colección de Germoplasma existente en Iquitos para intentar introducir brotes sin intermediación de callos. Primero se establecieron 11 introducciones con un promedio de 12 ápices por introducción; de éstas, el 50% presentaron oxidación severa y fue imposible continuar cultivándolas. Otro limitante fue la contaminación, que se incremento de 15% en el primer mes de cultivo de 44% el cuarto mes. En un paso subsiguiente, el medio basal (M y S), fue suplementado con 10 mg/L de BA mas de 3 mg/L de ANA. Se observaron protuberancias en cuatro de las 11 introducciones (182, 186, 253 y 292), las mismas que presentaron poca oxidación.

En una muestra de 100 ápices de hijuelos de plantas sin espina, se hizo un nuevo intento para introducir brotes laterales. Se presentó también el problema de contaminación tardía; en la 5ª semana la contaminación fue de 14% y en la 12ª semana alcanzó un 65%. Luego de 27 semanas de cultivo, el 21.3% de los ápices presentaron protuberancias con prominentes puntiagudas propias de brotes en estado inicial de desarrollo. En el ápice (1.25%) se diferenciaron seis brotes basales luego de 28 semanas de cultivo.

Control de oxidación

Con el fin de superar las limitaciones del cultivo de ápices y secciones de hojas por causa de la oxidación, se desarrollaron varios experimentos. La influencia de los factores ensayados sobre la oxidación se dan en este cuadro:



Influencia de distintas condiciones de cultivo sobre la oxidación de propágulos de pijuayo

Factor

Grados de libertad

F

Probab.

Signific.

Proágulo

Genotipo (introducción)

4

7.69

<0.0001

***

Ápices

Tipo propágulo (sec. Hoja sec. Tallo)

1

28.77

<0.0001

***

Sec. Hoja sec. Tallo

Luz (3000 luz y oscuridad)

1

4.46

0.035

*

Ápices

Altura de hij. (menor de 1 m y mayor de 1m)

1

0.17

0

NS

Ápices

Tiempo de cultivo (7,14,21 y 28 días)

3

168.69

<0.0001

***

Sec. Tallo

Antioxidante (Cisteína, KNO3, CA, ac. Ascorb. Tirosína)

6

19.46

<0.0001

***

Sec. tallo

Enjuague con Ac. Cítrico

1

0.47

0

NS

Sec. Tallo

Antioxidante (Cisteína y Caseína)

7

7.19

<0.0001

***

Hojas en ápices

Estad. Del medio (sólido, líq. Estát. Y líq. Agitado)

2

0.33

0

NS

Hojas en ápices

Días al recultivo (7,14,21)

2

20.11

<0.0001

***

Hojas en ápices

Antioxidante (Cisteína y Caseína)

7

28.84

<0.0001

***

Subapical en ápices

Estad. Del medio (sólido, líq. Estát. Y líq. Agitado)

2

20.49

<0.0001

***

Subapical en ápices

Días al recultivo (7,14,21)

2

39.02

<0.0001

***

Subapical en ápices

Antioxidante (Cisteína y CA)

3

3.65

0.044

*

Ápices

Como puede observarse en este cuadro, los factores: genotipo, tipo de propágulo, luz, tiempo de cultivo, estado del medio (en tejido subapical), y aditivos antioxidantes influenciaron significativamente sobre la oxidación. La altura del hijuelo, enjuague con ácido cítrico y estado físico del medio, (en secciones de hojas) son factores que no influenciaron visiblemente sobre la oxidación de los propágulos. En cuanto al estado físico del medio, fue notoria la ventaja del medio gelificado que en el medio líquido.

En le experimento 1, se confirmó la influencia del genotipo, lo mismo que fue observado repetidamente en otros ensayos (Pinedo, 1987. El trabajo de Valverde et al. (1987b), en concordancia con las experiencias de otros autores, dio a conocer el efecto oxidativo de la luz sobre callos previamente cultivados en oscuridad. Parece consistente que la luz estimuló el oscurecimiento de los tejidos, aunque en posteriores divisiones celulares sobre el tejido oxidado, solieron ocurrir procesos morfogenéticos.

En cuanto al tipo de propágulo, el tejido subapical oxidó mucho más que tejido foliar. El tejido subapical, por su mayor oxidación y contaminación resultó un propágulo difícil de cultivar. Sin embargo esta relación puede variar según el tipo de propágulo.

La diferencia altamente significativa detectada entre los antioxidantes, dio a lugar a una prueba de medias donde se observó que el tratamiento con cisteína (200mg/L) fue el más eficiente para controlar la oxidación en 28 días de cultivo. Sin embargo, en el experimento 3, el tratamiento correspondiente a caseína hidrolizada, (200mg/L) resultó superior a la caseína por su claro efecto antioxidante durante los 28 días de cultivo.

Aún cuando se observó el control de la oxidación mediante los tratamientos más destacados, se consideró que era necesario un control más eficiente para le caso de los ápices. De modo que se programó el Experimento Nº 5. en este experimento, se observó que el medio que controló mejor la oxidación de ápices, hasta las 16 semanas de cultivo, contenía 200 mg/L de caseína hidrolizada mas 3 gr/L de CA.

La oxidación de los tejidos de pijuayo cultivados in vitro, es influenciado fuertemente por el genotipo, tipo de propágulo, tiempo de cultivo, días al recultivo, estado del medio (en tejido Subapical), y del aditivo antioxidante.

Las secciones de tallo oxidaron mucho más que las secciones de hoja.

La oxidación de los propágulos se incrementó significativamente con el tiempo de cultivo y el tiempo de recultivo, evaluando en un período de 28 días después de la inoculación.

El estado del medio (en secciones de hojas) enjuague con ácido cítrico y altura de hijuelo, no influenciaron significativamente sobre el nivel de oxidación de los propágulos.

El uso de 200 mg/L de caseína hidrolizada más 3 gr/L de CA adicionado al medio de cultivo, redujo significativamente la oxidación de los ápices de pijuayo cultivados in vitro. Asimismo, el uso de medio gelificado y la ausencia de luz son favorables para disminuir la oxidación de los propágulos durante las primeras semanas del cultivo.

Con la combinación de 15 mg/L de ANA se indujeron seis brotes basales luego de siete meses de cultivo; esto ocurrió sólo en uno de 80 ápices cultivados.

Existen varias posibilidades, especialmente usando los ápices, para propagar el pijuayo in vitro. Se requiere intensificar la investigación para incrementar las tasas de crecimiento de los ápices de inducción de brotes. La caracterización a nivel celular de los eventos previos a la diferenciación de órganos o embrióides así como la génesis de los mismos, ayudarán a controlar estos eventos. La producción de embrióides vía callo, ha demostrado hasta el momento la tasa más alta de producción de plantas. Sin embargo, al igual que para la producción de brotes, no se dispone aún de una metodología aplicable masivamente. Aunque el cultivo de ápices es hasta el momento la ruta más promisoria, otros propágulos como las flores y secciones de tallo, podrían alcanzar tasa de multiplicación mucho más altas debido a una mayor disponibilidad de propágulos por planta.

Los resultados hasta hoy logrados, podrían fundamentar una predilección por los ápices como propágulos. Pero no hay consistencia en la repetitividad de los eventos morfogenéticos como para preferir una determinada vía de multiplicación (sea directa o vía callo. En ambas, el principal limitante es la baja tasa de multiplicación. En la vía directa, el crecimiento lento de los ápices podría ser un limitante de segundo orden. Los avances en el control de la oxidación aquí descritos, redujeron la importancia de ésta restricción.

DIFERENTES TIPOS DE FRUTOS






PARTE DE LA SEMILLA DE PIJUAYO




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