Anexos anexo 1 protocolo de ensayo con células Caco-2



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ANEXOS



ANEXO 1
A1. Protocolo de ensayo con células Caco-2

Los estudios de permeabilidad in vitro se han realizado en monocapas de carcinoma de colon, Caco-2 ATCC, cedidas por el Dr. Hu de la Universidad de estado Washington (USA).

A1.1 Cultivo celular

Los requisitos básicos para el mantenimiento de las líneas celulares son:

Estufa de incubación a una temperatura de 37°C, 5% de CO2 y 90% de humedad relativa. Estas condiciones son las adecuadas para el crecimiento de estas células.

i) Cámara de flujo laminar vertical de seguridad biológica, para trabajar en condiciones de mínimo riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. La manipulación de las células siempre tendrá lugar en el interior de la cámara.

ii) Baño termostatado. Permite que todas las soluciones que estarán en contacto con el cultivo se encuentren a 37°C.

iii) Bomba de vacío por membrana. Conectada a un dispositivo consistente en un kitasato con un tubo de silicona hacia la bomba y otro que asciende hasta la cámara de flujo. Facilita la aspiración del medio de cultivo y la filtración en la preparación de las diferentes soluciones de trabajo.

iv) Incubador con sistema de giro circular a 100 rpm., en el que se lleva a cabo el ensayo de permeabilidad. Permite simular las condiciones fisiológicas de movimiento y temperatura.

Los procedimientos normalizados de trabajo con este tipo de cultivos fueron preparados previamente por el equipo de investigación y se describen a continuación.



A1.1.1 Medio cultivo

Se prepara como mezcla estéril, conservándose viable dos meses en nevera aproximadamente, según la fórmula siguiente:

L-Glutamina 200 mM………………………10 ml

Solución Penicilina-Estreptomicina………..10 ml

Solución de aminoácidos no esenciales……..5 ml

HEPES 1 mM..................................................5 ml

Suero bovino fetal..........................................50 ml

DMEM sin piruvato……………………….....420 ml

En la fórmula se detallan como elementos distintas soluciones cuya composición se describe a continuación:

a) L-Glutamina 200 mM: L-Glutamina (Gibco®). Se utiliza como uno de los componentes nutritivos, ya que es un aminoácido esencial.

b) Solución Penicilina–Estreptomicina: Es una solución estéril compuesta por:

Penicinilina G (sal sódica)..............10.000 unidades/ml

Estreptomicina (sulfato) .................10.000 μg/ml

Ambas suministradas por Gibco®, evita la contaminación de los cultivos.

c) Suplemento de aminoácidos no esenciales: Solución acuosa de aminoácidos no esenciales suministrada por Gibco®.

d) DMEM: Líquido DMEM con alta concentración de glucosa (4.5 g/l) de Gibco®.



A1.1.2 Soluciones utilizadas para el pase

a) PBS-EDTA: Se comercializa en solución estéril por Gibco®. Se utiliza para el lavado de la monocapa y la eliminación de los residuos de suero que inactivarían la tripsina.

b)Tripsina-EDTA: Está compuesta por 0.5% de tripsina y 0.2% de EDTA-disódico exenta de

Ca+2 y Mg+2. Se comercializa en solución estéril por Gibco®. Esta solución se diluye 1/5 en PBS-EDTA estéril. Se utiliza para separar las células de los frascos en el proceso de pase de uno a otro.



A1.1.3 Crecimiento en frascos

Las células crecen en frascos de plástico estériles, en cuya base se forma una monocapa adherida. Para un correcto crecimiento hay que controlar dos aspectos:



  1. La renovación frecuente de medio, puesto que las células producen metabolitos que pueden alterar el pH fisiológico del mismo.

  2. La densidad de crecimiento, ya que las células deben tener siempre espacio para poder seguir desarrollando la monocapa.

El cambio del medio se realiza como se describe a continuación. Los frascos, situados en la estufa, se extraen, se pulverizan con alcohol al 70% y se introducen en la cámara de flujo laminar. El medio de cultivo atemperado se pulveriza con el mismo alcohol y se introduce también en la cámara. Cuando se ha evaporado el alcohol se abren parcialmente ambos tapones, frasco y botella de medio. Se coloca una pipeta Pasteur estéril en el tubo de silicona conectado a la bomba de vacío. Se introduce la pipeta evitando tocar el cuello del frasco o poner la mano derecha sobre la boca del frasco. Siempre se trabaja en posición oblícua, para disminuir así el riesgo de que cualquier tipo de partícula penetre por el cuello. La bomba aspira el medio que se recoge en el kitasato, se extrae la pipeta con cuidado y se cierra el frasco con los dedos pulgar e índice que en todo momento han sujetado el tapón sin permitir que este contactara con ningún objeto o superficie. A continuación, se rompe la cubierta de papel de una pipeta estéril de volumen adecuado por la parte superior, se conecta al pipeteador automático y, una vez insertada en éste, se desenvuelve totalmente, sosteniendo el pipeteador de forma análoga a como se procedía con la pipeta. Con la mano izquierda se abre la botella de medio colocada en un recipiente que permite mantenerla inclinada, haciendo más fácil la introducción de una pipeta en su interior. Se toma la cantidad adecuada de medio, se tapa la botella, se toma el frasco como se ha descrito previamente y se deposita con la pipeta el medio de cultivo procurando no tocar las paredes del frasco. El frasco se cierra completamente, se saca de la cámara, se pulveriza (especialmente el cuello) con alcohol al 70% y se introduce en la estufa.

Los cambios de medio se suelen realizar los lunes, miércoles y viernes. El volumen de medio es de unos 12 ml para los frascos de 75 cm2 y de 5 ml para los de 25 cm2.



A1.1.4 Dilución celular y cambio a nuevo frasco

La velocidad de crecimiento de este tipo de cultivos es muy rápida. Las células crecen formando monocapas que se adhieren a la base de los frascos. Cuando la monocapa ocupa toda la superficie disponible se deben despegar las células y sembrar en un nuevo frasco una dilución de la suspensión celular. En el caso de que no se realizara esta operación, las células comenzarían a degenerar, a formar vacuolas de reserva y a producir alteraciones importantes en las características típicas de la línea celular.

El procedimiento incluye primero un lavado de la monocapa con D-PBS, un tratamiento con tripsina y, por último, la dilución y cambio a un nuevo frasco.

El frasco contenedor se extrae de la estufa y se introduce en la cámara de la forma descrita en el epígrafe anterior. Las soluciones de medio de cultivo, DPBS y Tripsina-EDTA, atemperadas y pulverizadas con alcohol, se introducen también en la cámara. Una vez evaporado el alcohol, se aspira el medio de cultivo y se reemplaza por un volumen de D-PBS similar al volumen de medio correspondiente. Se deja actuar en la estufa durante 10 minutos, sacándolo de la cámara de la forma descrita anteriormente. Esta solución contiene Ca+2 y Mg+2 que eliminarán cualquier traza de suero presente en la monocapa, que podría disminuir la eficacia de la tripsina.

A continuación se saca de nuevo el frasco de la estufa y, en la cámara, se aspira el D-PBS y se sustituye por la cantidad adecuada de una solución de tripsina (1/5 del volumen de medio que se añade al frasco que se está utilizando). Se incuba de nuevo durante unos 10 minutos aproximadamente. La concentración de tripsina utilizada, el tipo de cultivo, la presencia de suero y de otros factores de crecimiento determinan la eficacia de la tripsina para despegar las células de la base del recipiente. En función de esto, se calcula el tiempo de actuación de la misma. Conviene eliminar o desactivar lo antes posible la tripsina, pues produce daños en las células.

Transcurridos los 10 minutos, las células se encuentran en suspensión en el medio tripsinizado; se adiciona medio de cultivo al recipiente, consiguiendo una dilución de la tripsina 1/5 e inactivándola gracias tanto a la dilución, como a la presencia de los diferentes factores de crecimiento y el suero bovino fetal del medio. Esta suspensión se agita con ayuda de la pipeta y el pipeteador; así, se separan las células. De esta suspensión se toma una pequeña cantidad que se introduce en un nuevo frasco que posee medio de cultivo de tal forma que se practica una dilución 1/5 sobre la inicial.

Es conveniente, al día siguiente de haber realizado esta operación, cambiar el medio de cultivo de los nuevos frascos. Se eliminan así las células que hayan muerto en el proceso y las trazas de tripsina. 24 horas son suficientes para que las células se fijen a la base del recipiente.

A1.2 Ensayo con células

A1.2.1 Preparación del ensayo

El ensayo se lleva a cabo generando una monocapa sobre membranas de policarbonato de 1 μm de tamaño de poro, con una superficie de 0.9 cm2. Estas membranas están insertadas en unas sujeciones de plástico que se colocan en el interior de los pocillos de unas placas de plástico, de tal forma que, el interior de las membranas simula la zona luminal y el pocillo en el que se coloca la zona basolateral.



A1.2.2 Sembrado celular

En primer lugar se lleva a cabo un lavado de la monocapa con D-PBS y el tratamiento con tripsina, según el procedimiento descrito. A continuación, la suspensión celular se coloca en un tubo de centrífuga estéril, se centrifuga 3 minutos a 1500 rpm y se elimina el sobrenadante, que incluye la tripsina. Esta operación se repite, para asegurar que no quedan trazas de la enzima.

El sembrado se realiza a una concentración de 250 células/μL. Así pues, hay que ajustar la suspensión celular a esta concentración con ayuda del microscopio y un hemocitómetro. Esta concentración está calculada para obtener la confluencia entre los 19-21 días postsembrado, lo que a su vez garantiza el desarrollo de todas las proteínas transportadoras características de este cultivo.

Tras la aspiración del sobrenadante se adiciona medio de cultivo y, con ayuda del pipeteador, se provoca la separación de las células para obtener una suspensión lo más homogénea posible. En este tubo se introduce una pipeta Pasteur y, por capilaridad, asciende parte de la suspensión de células. Ésta se coloca en el hemocitómetro y se lleva al microscopio para hacer el recuento.

El recuento se realiza en tres de los cuatro recuadros de los vértices. Se cuentan todas las células que quedan en el interior del cuadrado sin tocar los márgenes y sólo las células que se sitúan sobre dos de ellos, seleccionados de antemano. En la Figura III.4 se han dibujado en blanco las células que se admitirían en el recuento y en negro las que se excluirían de la selección, tomándose como válidos los márgenes superior e izquierdo. El número de células presentes en 0.1 μl, se obtiene como media de los tres recuentos.

Una vez conocida la densidad celular de la suspensión se calcula la dilución necesaria de la misma. En el interior de la cámara de flujo laminar se destapan las membranas y con unas pinzas se colocan en los pocillos tras comprobar que no existe ninguna alteración morfológica en la superficie. A los platos preparados, se adiciona 2 ml de medio de cultivo al pocillo y se comprueba que no quedan burbujas entre la membrana y el medio. En estas condiciones, se procede a sembrar la membrana con la suspensión celular preparada. Conviene dejar los platos inmóviles aproximadamente media hora, antes de llevarlos a la estufa, para que las células se asienten antes de ser sometidas a movimientos.





Figura A1.1 Hemocitómetro y vista microscópica para el contado de células

A partir del día de siembra los experimentos se podrán realizar entre el día 19 y el 21. Antes se considera que la confluencia no se ha alcanzado y después se manifiestan fenómenos de envejecimiento celular y comienza a faltar espacio en el inserto para su adecuado desarrollo.



A1.2.3 Crecimiento y desarrollo de las monocapas

Al día siguiente del sembrado debe cambiarse el medio de cultivo para eliminar las células que se mueren en este proceso. A partir de este momento, el medio se renueva en días alternos. El día previo al experimento se realiza un cambio de medio, pero esta vez con medio de cultivo sin antibióticos para evitar la interacción con nuestro fármaco el día del experimento.

El cambio de medio se realiza en la cámara de flujo, con ayuda de una pipeta Pasteur y la bomba de vacío; se aspira el medio del interior del pocillo y del inserto. Se sustituye por medio nuevo atemperado.

A1.2.4 Experimento

El ensayo se realiza en un incubador con agitación controlada (Rotamax®) a 37ºC. No son necesarias medidas de seguridad para evitar una posible contaminación pues el experimento dura pocas horas.



  1. Comprobación de la monocapa

Para comprobar la integridad de la monocapa se utilizó un micropolímetro (Millicell-ERS®). La medida de la resistencia eléctrica del inserto comparada con un inserto sin ningún tipo de crecimiento (control) es un índice contrastado de la seguridad de la monocapa.278

Las células se lavan tres veces con una solución atemperada de HBSS con HEPES. Con este tampón se lleva a cabo la medida de resistencia eléctrica.

En primer lugar se coloca un plato con un inserto sin crecimiento en el que sólo se encuentra la solución de HBSS con HEPES. Los electrodos se colocan uno en el interior del pocillo y el otro en el interior del inserto y se ajusta a cero el voltaje. De esta forma se calibra el micro-polímetro. A continuación, se mide la resistencia de este blanco en tres direcciones diferentes, para asegurar la confluencia en toda la superficie y se mide la resistencia de los insertos con crecimiento, inmersos en la misma solución que el blanco para mantener las condiciones. Si la resistencia en los insertos es 100 unidades superior a la del blanco, se considera íntegra la monocapa; en caso contrario, se desecha el pocillo.

Tras comprobar la integridad de la monocapa, los insertos se incuban en la estufa durante una hora con la solución de HBSS con HEPES con la que se midió la resistencia, con objeto de que las células expulsen cualquier residuo de suero e iones que pudieran interferir en el ensayo.



  1. Ensayo de permeabilidad

Se utiliza Solución compuesta de 99 ml de solución HBSS y 1 ml de solución HEPES 1 M como soluciones tampón para el ensayo. Esta solución se utilizará siempre en la cámara apical y basolateral, ya sea con fármaco o en ausencia de éste. También ésta se emplea para lavar las células antes del ensayo. Los compuestos se ensayan con diferentes concentraciones, libres en solución HBSS-HEPES con tres replicaciones para cada uno.

Los platos utilizados constan de 12 pocillos. Los ensayos se realizan de modo que en seis de los pocillos se estudia el transporte del metoprolol, en tres de ellos en sentido Apical-Basolateral, adicionando el fármaco en solución libre en el interior del inserto (cámara apical), y en otros tres se estudia el transporte Basolateral-Apical del fármaco, que se adiciona en el interior del pocillo (cámara basolateral). En los otros 6 pocillos se estudia el transporte del verapamilo de igual forma.

Se disponen 0.5 ml de solución en la cámara apical y 1.2 ml en la cámara basolateral. Cuando adicionemos el fármaco en la cámara dadora se dispondrán 0.2 ml más, que serán retirados inmediatamente a fin de tener una muestra a tiempo cero para conocer la concentración inicial exacta de la solución, a la vez que se pone en marcha el cronómetro. Las siguientes tomas de muestras se realizan en la cámara receptora y se repone el volumen extraído con HBSS-HEPES.


  1. Ensayo de recuperación

Finalizada la toma de muestras, las membranas se separan del inserto y se introducen en 1 ml de solución tampón. El fármaco retenido por las células, bien en su citoplasma o adherido a estructuras subcelulares, se extrae en dos operaciones:

- Congelación-descongelación rápida de la membrana en solución tampón, que se sumerge en nitrógeno líquido primero y en un baño a 37°C a continuación. Este proceso se realiza tres veces consecutivas. A continuación se centrifuga y se extraen 500 μl para valorarlo y que corresponde a la cantidad de compuesto retenido por la célula en solución.

- La otra alícuota se completa hasta 1 ml con metanol y se somete a agitación enérgica con el objetivo de romper las estructuras subcelulares para que liberen el compuesto, se centrifugan y, posteriormente se valora.

La cantidad de compuesto retenido en total corresponde a la suma de ambas valoraciones. Ello permite comprobar el balance de masas.



A.1.3 Tratamiento de muestras

Las muestras recogidas se centrifugan a 3000 rpm durante 3 minutos. De este modo, se obtiene un sobrenadante que contiene en disolución el compuesto ensayado y un sedimento sólido, que son restos de membrana que podrían alterar la valoración por obstrucción del sistema cromatográfico y causar la aparición de picos aleatorios u oscilaciones de la línea base. Por lo tanto, en el cromatógrafo sólo se introduce el sobrenadante de las muestras.

Aproximadamente 0.15 ml de este sobrenadante se coloca en los viales adecuados según el tipo de inyector automático que se vaya a utilizar. En nuestro caso se utilizaron viales Snap Cap ámbar de 2 ml de capacidad, con un inserto de vidrio en su interior con una capacidad de 0.2 ml, y con un tapón Septum propileno PTFE, con el fin de evitar evaporaciones.

A1.4 Cálculo de la permeabilidad

La valoración de las muestras permite conocer la cantidad de fármaco que aparece en el compartimento receptor a cada tiempo.

Considerando la condición de gradiente máximo, el proceso puede tratarse como una difusión pasiva y se aplica la ecuación diferencial (1.4). Después de estimar la pendiente de la recta obtenida al representar las cantidades acumuladas en compartimento receptor frente al tiempo, se puede conocer la permeabilidad aparente en este modelo in vitro, ya que:

(A1)

expresión en la que b es la pendiente de la recta mencionada.

En el caso que no se cumpla que la concentración de fármaco en el compartimento receptor a tiempo t no rebase nunca el 10% de la concentración inicial en el compartimento dador se aplica la corrección en concentración, asumiendo la condición de saturación (Ver sección 1.1.3.1).

La permeabilidad Papp se ha determinado en los dos sentidos: Apical-Basolateral y el contrario.



La regresión lineal por mínimos cuadrados para el cálculo de la permeabilidad se ha llevado a cabo mediante el paquete estadístico SPSS 17.



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