1 introduccion



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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Facultad de Ciencias Agrarias

Escuela de Agronomía

Detección de mutaciones asociadas a dureza de grano a 113 genotipos de trigo (Triticum aestivum L.) por medio de herramientas biotecnológicas

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Agronomía.

Profesor Patrocinante: Sr. Ricardo Riegel S. – Ing. Agr., Mg. Sc., Dr. rer. Nat. – Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

Mónica Lorena Mathias Ramwell

Valdivia Chile 2004

Profesores Informantes

Sr. Javier Zuñiga R. – Bioq. – Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

Sr. Claudio Jobet F. – Ing. Agr., Mg. Cs., Ph. D. - Instituto de Producción y Sanidad Vegetal.

RESUMEN


La elaboración de productos con harinas de trigo, dependiendo del tipo de procesamiento, exige diferentes tipos de calidad. La textura del endosperma es uno de los requerimientos más importantes. En general, las harinas provenientes de trigos duros son preferidas para la panificación, mientras que las de trigos blandos se usan en la elaboración de galletas y queques.

El trigo es alohexaploide (AABBDD) y se estima que hasta un 80% de la variación en textura está controlada por el locus HARDNESS, ubicado en el cromosoma 5D; ligados a éste se encuentran los genes de puroindolinas pina y pinb, proteínas del endosperma. La variación alélica en genes pin, producida por mutaciones, ha sido asociada a textura dura.

Con el objetivo de facilitar el mejoramiento genético para calidad industrial del trigo harinero, se adaptaron y desarrollaron métodos basados en PCR para la detección de los alelos de puroindolina: pina-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d. Se analizó un grupo de 113 genotipos pertenecientes al germoplasma del programa de mejoramiento de INIA-Carillanca y se encontró que el 55% contenía las mutaciones estudiadas; pinb-D1b representó el 40%, le siguieron en importancia pinb-D1c y pina-D1b, con un 8% y 7% respectivamente. El análisis de la textura medida por NIRS, demostró que el 94% del total de genotipos mutados perteneció a la categoría de textura de grano dura y el 6% restante a la de textura semidura.

SUMMARY


The product elaboration with wheat flours, depending on the type of processing, need different types of quality. The endosperm texture is one of the most important requirements. In general, flours originated from hard wheat are preferred for bread making whilst that of soft wheat is best suited for cakes and cookies.

The wheat is allohexaploid (AABBDD) and up to 80% of texture variation in this species is controlled by the HARDNESS (Ha) locus, located on the 5DS chromosome arm. Closely to Ha are the puroindoline pina and pinb genes, a pair of proteins from the endosperm tissue. The allelic variation in these genes as been associated with texture variation, and all the non wild-type alleles are strongly linked to hard endosperm.

Whit the objective to facilitate the breeding for industrial quality in Triticum aestivum L., PCR-based methods for the detection of the puroindoline alleles: pina-D1b, pinb-D1c and pinb-D1d were adapted and developed. A group of 113 genotypes from the program of wheat improvement of INIA-Carillanca was analyzed. Fifty five percent contained the studied mutations; pinb-D1b represented 40%, followed by pinb-D1c and pina-D1b, with a 8% and 7% respectively. The analysis of the texture measured by NIR, demonstrated that 94% of the total of mutated genotypes belonged to the category of hard grain texture and 6% to the intermediate texture.

1. INTRODUCCION


El trigo harinero (Triticum aestivum L.) es fuente primaria de alimentación y uno de los cereales más cultivados en el mundo. Una propiedad única de las harinas obtenidas a partir del trigo es su capacidad para formar una estructura proteica viscosa y elástica llamada gluten. Esta cualidad hace que la harina del trigo se emplee en la manufactura de diferentes productos entre los que destacan distintos tipos de pan, galletas y biscochos.

La manufactura de los variados productos basados en harina de trigo requiere características industriales específicas. La textura del grano es uno de los requerimientos de calidad más importante, puesto que define el uso final: en general, las harinas provenientes de trigos de textura dura son preferidas para la panificación, mientras que las provenientes de trigos de textura blanda son preferidas para la elaboración de galletas y queques.

Las diferencias en textura de grano que presentan las distintas variedades de trigo, pueden estar asociadas a variación en el grado de interacción entre los gránulos de almidón y la matriz de proteínas del endosperma.

Aunque genéticamente el trigo es alohexaploide (genomas AA BB DD), hasta un 80% de la variación en textura de grano está controlada por un solo locus, denominado Ha (HARDNESS), que se ubica en el brazo corto del cromosoma 5D. Otros factores como el contenido de arabinoxilano (un pentosano) y de proteína influencian la textura en menor medida.

Recientemente, la variación alélica en la secuencia aminoacídica de unas proteínas conocidas como puroindolinas, asociadas a la superficie de los granos de almidón en el endosperma, ha sido fuertemente asociada con la variación en textura de grano. Los genes de puroindolinas se encuentran estrechamente ligados al locus Ha, sugiriendo un rol primario de estas proteínas en la determinación de la textura, o que ellas están ligadas genéticamente a los factores determinantes codificados por el locus Ha.

Los distintos alelos de puroindolinas pueden detectarse por medio de técnicas como la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR), electroforesis desnaturante de proteínas (SDS-PAGE) y Cleavage Amplified Polymorphic Sequence (CAPS). Esta cualidad tiene enorme impacto en el mejoramiento genético del trigo, pues permite reconocer con precisión y rapidez las plantas que los portan, evitándose así la variación por efecto del medioambiente y el avance de plantas sin mérito genético. Las técnicas mencionadas requieren pequeñas cantidades de material vegetativo o grano, con lo cual es posible analizar tempranamente plántulas en desarrollo de poblaciones segregantes o líneas doblehaploides. En 1999, INIA-Carillanca comenzó a aplicar este enfoque en la caracterización de progenitores y la selección para el alelo pinb-D1b en poblaciones doblehaploides de trigo. Sin embargo, plantas fenotípicamente duras no mostraban reacción positiva en el ensayo, al tiempo que nuevos alelos y métodos para su diagnóstico eran reportados en la literatura.

Como hipótesis de este trabajo de tesis, se plantea que existen distintas variantes alélicas de los genes de puroindolinas en el pool genético de trigos de textura dura del Programa de Fitomejoramiento de Trigos de INIA Carillanca.

El objetivo general corresponde a la adaptación y el desarrollo de métodos que permitan y faciliten el diagnóstico molecular de alelos condicionantes de textura dura en granos de trigo harinero.

Con el fin de lograr el objetivo general y probar la hipótesis planteada, se establecieron los siguientes objetivos específicos:

Adaptar y desarrollar métodos basados en PCR para la detección de los alelos de puroindolina pina-D1b, pinb-D1c y pinb-D1d.

Caracterizar los alelos de puroindolina presentes en el pool genético de trigos de textura dura, del Programa de Fitomejoramiento de Trigos de INIA Carillanca.



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